關于發布《2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術審評要點》的通告（2020年第4號）

2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術審評要點

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一、適用范圍

2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑用于對咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物等樣本中的2019新型冠狀病毒核酸進行體外定性檢測。本審評要點適用于進行首次注冊申報的產品。

二、性能評估：

企業應提交在符合質量管理體系的生產環境下生產的試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、實驗方案、實驗數據、統計分析等詳細資料。建議著重對以下分析性能進行研究。1.核酸（RNA）提取/純化性能在進行靶核酸檢測前，應有核酸（RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有RNA分離/純化的組分，企業都應結合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸提取試劑/方法的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證，提供詳細的驗證資料。2.最低檢測限（1）最低檢測限的確定將含有2019新型冠狀病毒的真實臨床樣本/含有該病毒RNA片段的假病毒顆粒梯度稀釋于（與適用樣本一致的）適當基質中，用于進行最低檢測限研究，應采用科學的方法標定病毒滴度。每個濃度梯度最少重復三次檢測，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計檢測限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣品，每個濃度至少重復20次檢測，將具有90%～95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢測限。在進行最低檢測限的確定時，應至少包括不同來源的三個具有代表性的2019新型冠狀病毒樣本，進行系列梯度稀釋。（2）最低檢測限的驗證選擇不同來源的至少3個病毒樣本（與最低檢測限確定不同的病毒樣本）在最低檢測限濃度水平進行驗證，應達到90%～95%陽性檢出率。應提供詳細的病毒液滴度的確定方法及驗證結果。3.不同區域病毒樣本包容性的驗證至少驗證包括具有時間和區域特征性的10個不同來源的病毒樣本（陽性臨床樣本或分離培養物），應包括最低檢出限、重復性等性能的驗證，病毒樣本的滴度應采用科學合理的方法進行標定。4.分析特異性（1）交叉反應驗證包括：①地方性人類冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒；H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C組，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，腸道病毒A、B、C、D組，人間質肺病毒、人偏肺病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨細胞病毒、輪狀病毒、諾如病毒、腮腺炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒；肺炎支原體、肺炎衣原體；軍團菌、百日咳桿菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、肺炎克雷伯菌、結核分枝桿菌；?煙曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌等。建議在病毒和細菌感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證。通常，細菌感染的濃度水平為10⁶cfu/ml或更高，病毒為10⁵pfu/ml或更高，提供所有用于交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。②人類基因組DNA。（2）內源/外源物質干擾應根據所采集樣本類型，針對可能存在的干擾情況進行驗證。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價，在病毒臨界陽性水平進行干擾試驗驗證。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質（如血液、鼻腔分泌物、粘液及用于緩解淤血、鼻噪、刺激或哮喘和過敏癥狀的鼻腔和咽喉藥物、抗菌藥物、抗病毒藥物等）及在樣本采集和制備期間引入的物質。表1 推薦用于干擾試驗的物質

三、注冊檢驗

應提供符合產品技術要求的、在具有相應醫療器械檢驗資質和承檢范圍的醫療器械檢驗機構進行的產品檢驗報告，應提供連續3個生產批次樣品的檢驗合格報告。該項目已有國家參考品，應使用國家參考品進行注冊檢驗。

四、陽性判斷值確定資料

陽性判斷值確定資料主要指對申報產品病毒核酸檢測的Ct值，即結果判斷的臨界值進行確認的資料。陽性判斷值研究資料樣本來源應考慮不同年齡、性別、地域等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性。如存在判定值灰區，應提供灰區的確認資料。應說明所選擇陽性判斷值研究方法的合理性，閾值設置應科學合理。提供內標值的確定方法和研究資料。

五、主要原材料研究資料

此產品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質控品、參考品等。應提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質量標準等相關研究資料、質控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業自制，應提供其詳細制備過程；如主要原材料源于外購，應提供資料包括：選擇該原材料的依據及對比篩選試驗資料、供貨方提供的質量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料。1.引物和探針：應詳述引物和探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應情況。建議每種病毒設計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和試驗等方式，對病毒進行包容性和特異性（如交叉反應）的評價，選擇最佳組合，并提交篩選的研究數據。引物、探針的質量標準應至少包括序列準確性、純度、濃度及功能性實驗等。2.脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP、dTTP，應提供對其純度、濃度、功能性等的詳細驗證資料。3.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應分別對酶活性、功能性等進行評價和驗證。4.試劑盒內質控品試劑盒的質控體系通過設置各種試劑盒質控品來實現，其應參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程。以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設備、交叉污染等環節進行合理質量控制。申報資料應對試劑盒質控品有關原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料詳細說明。企業應對質控品的檢測結果（如Ct值）做出明確的范圍要求。4.1陰性質控品應不含試劑盒所檢測的靶序列。4.2陽性質控品陽性質控品可用1～2個病毒株為代表，應含有天然的或人工合成的包含試劑盒可檢測靶序列（如假病毒）。?5.內對照（內標）可以對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，應與靶核酸一同提取及擴增，申請人應對內對照（內標）的引物、探針設計和模板濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。對內對照的檢測結果（如Ct值）亦應做出明確的范圍要求。建議科學設置內對照（內標），對待側樣本的取樣質量、試劑的反應體系進行監控。6.企業參考品應根據產品性能驗證的實際需要自行設定企業內部參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、重復性參考品。陽性參考品應著重考慮不同來源的病毒樣本和滴度要求，應至少選取不同來源的5個病毒樣本。陰性參考品則主要涉及對交叉反應的驗證情況，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠狀病毒（可采用假病毒）、MERS冠狀病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。檢測限參考品的濃度水平可采用90～95%陽性檢出水平或略高于最低檢測限的水平，如100%陽性檢出水平。檢測限參考品的濃度確定應科學合理。重復性參考品建議包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應為最低檢出限附近的濃度。申請人應對內部參考品的來源、型別鑒定、病毒滴度等信息進行精確的試驗驗證，并提交詳細的驗證資料。

六、主要生產工藝及反應體系的研究資料

1.介紹產品主要生產工藝，可用圖表方式表示，并說明主要生產工藝的確定依據。2.反應原理介紹。3.詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇和設置，提供相關的研究資料。（1）研究樣本采集時間點的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。（2）研究對采樣拭子及樣本保存液的要求：對采樣拭子的材質要求（包括對拭子頭和拭子桿的要求），保存容器要求，裂解液、保存液成分、濃度、使用量的要求等。4.確定最佳反應體系的研究資料，包括樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應各階段溫度、時間、循環數等。建議在保證核酸提取純度的情況下盡量擴大總反應體系和加樣量。5.不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。6.如申報產品包含核酸分離/純化試劑，應提交對核酸分離/純化過程進行工藝優化的研究資料。

附表：