醫療器械創新網
假陰性問題沒那么簡單
國家衛建委：結果陰性也可能感染
?
2月21日，國家衛健委印發《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第五版）》，在實驗室檢測技術指南中明確指出，核酸檢測結果陰性不能排除新冠病毒感染，需要排除可能產生假陰性的因素。
?
具體因素包括：樣本質量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確保存、運輸和處理樣本；技術本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。
?
近日在廣東省人民政府新聞辦公室舉行發布會上，國家衛健委高級別專家組組長、中國工程院院士鐘南山也表示，用核酸檢測確診是正確的，但還要看取材，絕大多數采樣是取鼻和咽，如果采樣不準確，會造成很大的結果差異。
?
同時鐘南山還表示，核酸檢測的準確性并沒有媒體說的那么低。之前有媒體報道稱，核酸檢測的準確率只有30%-50%左右，有的甚至說只有20%-30%，其實核酸檢測應該是比較準確的。
?
核酸檢測準確率不會這么低，但國內也確有患者檢測4次都是陰性，第5次才是陽性的情況。
?
2月8日，浙江青田縣新型冠狀病毒感染的肺炎疫情防控工作指揮部發布公告稱，51歲男性患者章某某，2月1日起連續4次核酸檢測均為陰性，2月7日第5次核酸檢測呈陽性，確診為新型冠狀病毒感染的肺炎病例。
?
1月30日《人民日報》報道，天津一例新型冠狀病毒患者在1月25日、1月28日共進行3次核酸檢測，都為陰性，但是在1月30日的第四次檢測中呈陽性。
?
檢測四五次才能確診，這些真的是因為新型冠狀病毒太狡猾嗎？
?
核酸檢測是金標準，沒有疑問
?
想知道為什么出現假陰性，就要知道核酸檢測試劑盒如何檢測新冠病毒。
?
根據國家衛健委臨床檢驗中心介紹，新型冠狀病毒與2003年的SARS冠狀病毒一樣，由RNA核酸和蛋白等組成。RNA核酸由四種不同堿基排列而成，不同病毒的核酸堿基排列方式，就像發報的密電碼，各有不同。
?
因此可以通過采集人的特定部位細胞樣本，檢測其中是否含有病毒RNA核酸，確認機體是否受到感染。
?
核酸檢測就像分析密電碼，新型冠狀病毒也有其特異的密電碼，但與其它冠狀病毒也有相似性，根據2月19日國家衛健委發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》，目前研究顯示，新型冠狀病毒與蝙蝠SARS樣冠狀病毒同源性達85%以上。
?
新型冠狀病毒的RNA核酸約有3萬個堿基，不同區域和其它冠狀病毒的相似性有所不同，有些區域相似度高達90%以上，因此核酸檢測試劑選擇相似度低的區域進行，這樣就可以特異地識別新型冠狀病毒。
?
就像同一地區身份證號有幾位數字相同，那么就通過其他區域的數字對個人進行區分。
?
進行區域識別后，如果核酸檢測結果為陽性，即證明新冠病毒特有的RNA核酸存在，即感染新冠病毒。通常我們說病毒核酸檢測是確診感染的“金標準”，這個“金標準”就是指“陽性”結果。
?
近期有部分一線醫生和業內人士建議將CT也作為診斷標準，但嚴格來講，CT的準確性比不上核酸檢驗，更無法替代核酸檢測。
?
近日中華醫學會檢驗醫學分會主任委員王成彬發布文章表示，核酸檢測從方法學層面考慮其作為實驗室診斷金標準沒有任何疑問。
?
CT作為臨床影像學篩查指標具有重要價值，但無論從早期診斷、鑒別診斷、排除診斷還是最終確診等方面都還具有一定的局限性，更無法替代病原學診斷。
?
假陰性的四方面原因
?
對核酸檢驗假陰性，不少聲音將原因指向核酸檢測試劑盒，但實際上核酸檢測是一個流程，任何一個環節出現問題，都有可能導致假陰性。
?
根據國家衛健委臨床檢驗中心信息，在被感染者中檢出核酸，需同時滿足以下四個條件：
?
（1）被感染者的細胞中有一定量的病毒；
（2）采集標本時，必須采集到含有病毒的細胞；
（3）可靠的體外診斷試劑；
（4） 規范的臨床核酸檢測實驗室（合理的分區、有能力的檢測人員和嚴格的質量管理體系）。
?
以上4個條件就是可能導致假陰性的4方面因素。
?
患者：可能病毒含量太少
?
核算檢測試劑對感染者體內的病毒存在量有一定要求，如果病毒含量太少，現有的方法或許檢測不到。
?
據了解，新冠肺炎患者的發病都會經歷一個從感染后無癥狀，到輕度癥狀出現，再到嚴重癥狀出現的過程。
不同病程、不同病情患者機體中的病毒存在量可能不同，已有病毒感染，但由于在相關部位采集不到病毒或采集到的病毒量太少，以致于現有方法檢測不到，也稱窗口期。
?
王成彬表示，對臨床高度疑似新冠肺炎患者，應該連續采集標本進行檢測，這可能是臨床患者多次檢測陰性，陽性結果出現晚的主要原因之一。
?
其實任何病原學檢測，都不能只根據一次陰性結果而做出排除性診斷，更不能根據核酸檢測陰性而漏診臨床高度疑似的新冠肺炎患者，尤其在高發地區，在大面積流行期間。
?
此外，患者不同部位的病毒存量也不一樣。
?
機體被病毒感染后，病毒通過鼻腔和口腔進入到咽喉部，再到氣管和支氣管，進而到達肺泡，不同病程階段以及機體不同部位存在的病毒量有所不同，由這些部位細胞所含病毒受體占比不同所致。
?
新型冠狀病毒感染，肺泡上皮細胞的病毒受體表達占比最高，氣道上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞和巨噬細胞等則占比極低。
?
因此，下呼吸道的病毒量明顯高于上呼吸道，呼吸道病毒檢出可能性又高于血液。肺泡灌洗液中最容易檢出病毒核酸，其次是深咳痰，再是鼻咽部，再次是口咽部。
?
但是采集肺泡灌洗液的標本卻沒有那么簡單。
?
標本：假陰性無法完全避免
?
根據王成彬表述，很多專家從實踐工作中總結出的經驗認為，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液標本陽性率高于上呼吸道的口鼻咽拭子采集的標本；鼻咽拭子標本檢測陽性率又高于口咽拭子。
?
口鼻咽拭子這也是這兩天被廣泛評論的某患者咽拭子標本三次核酸檢測陰性，收住院后在搶救過程中采集肺泡灌洗液標本核酸檢測陽性的原因。
?
雖然肺泡灌洗液的陽性率最高，但是操作復雜，采集難度大，而且容易引起患者噴射，導致采集操作者感染風險大，因此難以作為常規采樣方法，只有部分氣管切開、上呼吸機搶救病人可用。
?
此外根據國家衛健委檢驗中心信息，新冠肺炎患者通常為干咳，下呼吸道的痰標本也較難得到。
?
由于操作的方便性和患者的接受程度，目前臨床最常用的標本是口咽部拭子，其次是鼻咽部拭子。
?
因此，采集部位不當，如采集口咽拭子時，采集深度不夠；采集鼻咽拭子沒有采到鼻腔深處等，采集到的細胞可能大部分都不含病毒，即可能造成假陰性。
?
此外，如果平時醫護人員咽拭子取樣不多，刮取標本時患者的反應又比較大，往往導致刮取標本的位置不對，或力度和時間不夠，沒有刮取到帶病毒的標本或刮取到的帶病毒標本量少，最后也會導致檢測結果陰性。
?
對比國家衛健委發布的第四版、第五版和第六版診療方案可以發現，第五版已經將第四版的“咽拭子”改為“鼻咽拭子”。
?
第六版又添加內容強調：為提高核酸檢測陽性率，建議盡可能留取痰液，實施氣管插管患者采集下呼吸道分泌物，標本采集后盡快送檢。
?
采集患者標本的重點已經越來越偏向下呼吸道，檢驗的陽性率或許也將明顯提高。
?
實際上，在樣本中尋找病毒，就像在一本百萬字的書里尋找錯別字，理論上說，即使只有一個錯別字也可以被發現。
?
但實際上，由于成本和時間等的限制，只能從中隨機抽取10萬或者20萬字進行查找，如果錯別字數較少，就有可能不在被抽取的字數當中，因此無法找到。
?
同樣，樣本中病毒數量低于一定程度，試劑也就無法檢出。因此從這個層面上看，病毒核酸檢測的“假陰性”或許是無法完全避免的。
?
檢測試劑：火速獲批，質量或參差不齊
?
疫情面前，檢測試劑獲批十分迅速。
?
1月26日國家藥監局發布消息表示，已應急審批通過4家企業4個新型冠狀病毒檢測產品，包括華大基因新型冠狀病毒檢測試劑盒、華大智造DNBSEQ-T7測序系統獲批、上海捷諾rtpcr、上海之江rtpcr。
?
據了解，國家藥監局啟動應急審批程序，僅4天就批準四家公司四個產品，緊急應對疫情。目前已有多家械企完成新冠病毒檢測試劑的研發或者獲得注冊證。
?
根據上市公司公告，達安基因已獲得新型冠狀病毒（2019-nCoV)核酸檢測試劑盒（熒光 PCR法）的醫療器械注冊證。
迪安診斷、萬孚生物、美康生物、透景生命等械企都已完成新型冠狀病毒（2019-nCoV）系列檢測試劑新品的研發，部分已進入應急審批通道。
?
據不完全統計，目前有超過130家企業在生產新型冠狀病毒相關檢測試劑。
?
對于這些檢測試劑的質量，近日重慶市人民醫院三院院區檢驗科發布《6 種國產新型冠狀病毒核酸檢測試劑檢測性能比較與分析》（下稱《比較與分析》）。
?
上述檢驗科醫務人員收集院內1 例弱陽性患者不同時間點采集的咽拭子標本。因為弱陽性樣品往往對試劑盒的靈敏度有較高要求，如果最低檢出限達不到樣品的檢測濃度，則會導致假陰性結果。
?
根據《比較與分析》，試驗具體選取了圣湘生物、北京卡尤迪、碩世生物、中元生物、中山達安和北京卓成惠生的新冠病毒核酸檢測試劑盒，基因檢測類型均為 ORF1ab 和 N 基因兩個靶點。
?
最終研究結果表明，國產 6 種試劑對弱陽性樣品的檢測能力參差不齊，少數試劑對兩個基因靶點均能檢出，而部分試劑只能檢測出其中一個。
?
從試劑方面分析原因，可能與試劑引物設計有關，也可能與各位點檢測靈敏度相關。
?
某知名診斷械企相關負責人對賽柏藍器械表示，檢測試劑靈敏度是個重要因素，因為DNA比RNA穩定，所以要先把RNA逆轉錄成DNA，到一定濃度后，通過試劑中的引物和探針對相應基因靶點進行檢測。
?
每個廠家試劑中引物和探針的靈敏度都有區別，濃度、純化程度以及試劑中酶、金屬離子等成分與質量的差異，都可能影響擴增效率和最后檢測結果的靈敏度。
?
王成彬分析稱，由于本次疫情的特殊和緊迫性，很多廠家研發試劑來不及完成正常流程，無法得到一定數量臨床患者標本的驗證，只能通過模擬真實標本中的病毒進行驗證。
?
國家衛健委臨床檢驗中心也表示，部分廠家的試劑產品由于研發時間短，也沒有使用已知臨床樣本進行必要的性能確認，可能存在對試劑優化不充分以及試劑批間差異大等問題。
實驗室：30家機構，符合率100%
?
除了檢測試劑本身，實驗室規范與否也會對檢測結果產生重要影響。標本運輸保存條件、臨床實驗室的規范操作、結果判讀和質量控制等都是保證檢測結果準確可靠的關鍵因素。
?
那么我國實驗室的檢測能力如何？
?
近日根據中華醫學會檢驗醫學分會消息，貴州省臨床檢驗中心組織了針對省內34家新型冠狀病毒核酸檢測實驗室進行技術考核，考核品一共分10個批次，包括陰性、弱陽性和陽性。
?
最終結果顯示，考核發放樣品34家，至規定時間回收結果30份。在30家檢測機構，總符合率為100%。
?
其中陽性樣品符合率、陰性樣品符合率、全省疾控系統總符合率、全省醫療機構總符合率、第三方機構總符合率均為100%。本次考核，一共涉及6個廠家試劑，其符合率也為100%。
?
貴州省臨床試驗中心表示，在回報的30家檢測實驗室中，用于考核樣品檢測的一共為6家產品，并且主要集中在傳統的2家基因試劑廠家上，占87%左右。
?
貴州省臨床試驗中心認為，對于社會關注的核酸檢測陽性率低的問題，主要是由病人疾病發展過程、標本采集、標本保存與運輸等問題引起。加強與臨床和疾控采樣人員的溝通和聯系，共同對分析前質量進行管理，以保障檢驗質量，其意義非常重要。
?
據了解，2月21日國家衛健委印發的《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第五版）》，同時發布的《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南》對標本采集、處理、包裝、保存、送檢、檢測以及等實驗室檢測技術提出詳細要求。
?
例如采集咽拭子時，要求被采集人員頭部微仰，嘴張大，并發“啊”音，露出兩側咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次進行采集。
?
以此規范標本采集等流程操作，盡量避免影響檢驗結果。
?
抗體檢測輔助，降低假陰性率
?
綜上所述，核酸檢驗的假陰性有多方面因素，如標本中尋找病毒有概率性、不可能所有醫護人員都操作規范等，類似這樣的問題一時難以解決，但并不代表沒有其他辦法有效降低假陰性的概率。
?
2月15日據央視新聞報道，在鐘南山院士的指導下，實驗室聯合多家研究機構，最新研發出新型冠狀病毒IgM抗體快速檢測試劑盒，并已在實驗室和臨床完成初步評價。
?
據介紹，此試劑盒僅需采取一滴血就可在15分鐘內肉眼觀察獲得檢測結果，且患者的血漿稀釋500至1000倍后，仍能檢測出陽性條帶。
?
國家衛健委臨床檢驗中心表示，補充新型冠狀病毒特異抗體檢測，這一辦法對降低假陰性率行之有效。
?
據國家藥監局器審中心官微介紹，特異性抗體檢測是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過抗原檢測抗體的存在，間接證明人體已感染或曾感染新型冠狀病毒。
?
據了解，檢測的抗體主要分為IgM和IgG兩類。一般IgM抗體在感染早期出現，IgG抗體在感染中晚期出現，滴度有一個持續增高的過程，并在血液循環中保持較長時間存在。
?
但是要注意，雖然抗體檢測能在一定程度上證明人體感染病毒，但并不能取代核酸檢驗的金標準地位。
?
國家衛健委臨床檢驗中心強調，檢測特異抗體也可以明確患者是否“近期或既往感染過新型冠狀病毒”，有助于核酸檢測陰性但臨床上疑似患者的確診。
?
但是特異抗體檢測陽性不能像病毒核酸檢測陽性一樣作為病毒感染的“金標準”，因為抗體檢測容易受到血液標本中的一些干擾物質，如類風濕因子、非特異IgM、溶血所致的高濃度血紅蛋白等的存在而出現“假陽性”結果。
?
與此同時，已有械企完成研發或取得相關產品的注冊證。
?
2月21日，安圖生物發布公告稱，近日已取得抗體檢測試劑盒的《醫療器械注冊證》，具體包括肺炎支原體 IgG 抗體檢測試劑盒、呼吸道合胞病毒IgM 抗體檢測試劑盒、腸 道 病毒 71 型IgM 抗體檢測試劑盒。
?
2月20日，萬孚生物發布公告稱，公司收到國務院通知，申報的適宜于疫情現場的新型冠狀病毒抗原快速檢測試劑、基于熒光微球/膠體金免疫層析技術新型冠狀病毒抗體快速檢測試劑，二個項目的產品推薦進入應急審批通道。
2月21日，邁克生物發布公告稱，目前公司已完成新型冠狀病毒 IgG 和 IgM 抗體檢測試劑盒（直接化學發光法）、新型冠狀病毒（SARS-Cov-2）IgG/IgM 抗體檢測試劑盒（膠體金法）的研發工作。
