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前言
2019年12月底，在中國湖北省武漢市當地的一個海鮮和野生動物交易市場：武漢華南海鮮市場，一種可導致不明原因肺炎的病毒爆發了。在2020年1月7日，中國疾控中心CCDC確證了這是一種新型冠狀病毒。2020年2月11日，世界衛生組織將這次大規模流行疾病命名為2019-nCoV（2019-novel coronavirus disease），也稱為COVID-19.?此外，國際病毒分類委員會將2019-nCoV命名為嚴重急性呼吸系統綜合癥冠狀病毒2（SARS-CoV-2）。2020年3月，COVID-19在全球爆發。新型冠狀病毒從屬于Coronaviridae?Nidovirales?中的beta型（betaCoV），是一類衣殼包裹的單鏈RNA病毒。通常BetaCoV以嚙齒類動物作為宿主，在無中間宿主的情況下很少感染到人類。然而分別在2003年爆發的SARS，和在2016年爆發的MERS同樣從屬于BetaCoV，并對人類的公共衛生安全造成了巨大的傷害。研究表明，新冠病毒與蝙蝠冠狀病毒RaTG13具有98%的相似度，與蝙蝠類SARS病毒CoVZXC21具有89%的核苷酸序列相似性，與人類SARS病毒有79%的同源性。截止到目前，尚未出現對于新冠病毒有效的治療手段和藥物。
本次新冠病毒的爆發給我們帶來了前所未有的危機，對人類健康和生命造成巨大的威脅，給全球經濟帶來了災難性的損失。值得慶幸的是，21世紀以來生物科學的快速發展極大的提高了全球針對重大傳染性疾病的應對能力。在本次疫情爆發的幾天內，新冠病毒的完整基因組數據即被公開，一個月內，針對新冠病毒的核酸檢測試劑盒即開發完畢、投入使用。目前，全世界的科學家、醫務工作者、生物醫藥企業等已經團結起來，對該疾病進行更加深入的了解，為遏制新冠病毒的轉播及開發有效的治療、預防手段貢獻力量。
本文將從COVID-19致病機理、檢測/診斷技術兩個方面，淺述生物技術在新冠病毒診療中的應用。
CO-19致病機理
與其他的感染呼吸道的冠狀病毒類似，SARS-CoV-2主要是通過空氣傳播：病毒通過空氣中的小液滴或氣溶膠被吸入肺部，從而感染患者。另外，SARS-CoV-2還存在尚未被確證的糞-口傳match播途徑。新冠病毒的平均潛伏期中位數約在4～5天，之后97.5%的感染者在11.5天內出現感染癥狀。其典型的早期感染癥狀與SARS十分類似，包括發熱、干咳，一些病人出現呼吸困難、肌肉/關節疼痛、頭暈/頭痛、腹瀉、嘔吐及咳血等癥狀。癥狀出現5～6天后，病毒載量達到高峰，隨著病毒對下呼吸道的感染升級，氣道的炎癥反應加劇，導致肺部組織破壞，一些嚴重的患者在癥狀出現8～9天左右出現急性呼吸窘迫癥ARDS（表現為呼吸困難和血氧濃度降低）、細菌和真菌的繼發性感染、免疫系統大量分泌抗炎細胞因子形成細胞因子風暴（CRS），以及多臟器衰竭等。最終，一些患者由于血氧過低、臟器衰竭等走向死亡（男性死亡率2.8%，女性死亡率1.7%）。
SARS-CoV-2通過其病毒衣殼上的刺突蛋白S中的RBD（receptor-binding domain）靶向呼吸道中的上皮細胞、肺泡上皮細胞、血管內皮細胞和巨噬細胞表面表達的ACE2（angiotensin-converting enzyme 2）。如圖所示，在感染過程中，SARS-CoV-2的RBD與細胞表面的ACE2結合，誘導細胞的內吞作用。在該作用中細胞絲氨酸蛋白酶TMPRSS2也起到了一定的輔助。通過內吞，病毒的RNA順利進入細胞質并進行迅速的翻譯、表達、復制，造成細胞的裂解以及ATP、核苷酸等大量釋放。這些細胞損傷信號被周圍的上皮細胞、內皮細胞、肺泡巨噬細胞等接收，并誘導它們釋放出IL-6，IP-10，MIP1alpha，MIP1beta，以及MCP1等炎性因子。這些炎性因子吸引單核細胞、巨噬細胞和T細胞至感染處，進一步促進炎癥反應，形成正向反饋機制。
在免疫應答不健全的情況下（圖左），可造成更多的免疫細胞在肺部聚集，炎癥反應加劇，最終導致肺部組織的破壞。而高濃度的炎癥因子會隨血液全身循環至多處臟器，造成多臟器損傷。此外B細胞分泌的非中和抗體（通過ADE. antibody-dependent enhancement），進一步加劇了器官損傷，最終導致器官衰竭。然而在正常的免疫應答中（圖右），T細胞可在病毒擴散之前清除感染的細胞?；颊唧w內產生的中和抗體可遏制病毒進一步感染、擴散，肺泡中的巨噬細胞可通過吞噬作用清除被中和的病毒顆粒和凋亡的細胞?？焖俚牟《厩宄杀苊獠槐匾难装Y反應，從而將肺部損傷降到最低，促進肺組織的痊愈。
圖1.新冠病毒感染細胞過程（圖源：Nature?Review?Immunology）??
COVID-19體外檢測技術
?對于新型冠狀病毒的檢測對于預防、防治疾病擴散和進展具有舉足輕重的作用。在疫情爆發的早期，由于人們對于疾病的認知不足，很容易從一些共有的臨床表現上，把新冠和其他的肺炎、流感、普通感冒發燒混淆在一起。再加上新冠病毒的傳播能力強、速度快、致死率高，如何有效、快速、準確的診斷出新冠感染患者，及時施以隔離、干預和入院治療等手段，最大程度的切斷感染源，挽救更多患者的生命成為此次疫情防治中的重中之重。
?病毒檢測一般分為直接法和間接法。直接法包括病毒特異性抗原檢測和病毒核酸檢測（DNA或RNA）；間接法即血清IgM和IgG抗體檢測。在不同的病毒感染周期內，病毒的滴度在體內的分布發生變化，例如，在新冠感染的初期，病毒在下呼吸道大量繁殖，因而痰液、肺泡灌洗液濃度最高，隨后病毒獲得較強傳播能力，因而在上呼吸道中鼻咽拭子樣本中濃度更高，在患者逐漸康復過程中，其肛拭子的含量可能高于鼻咽拭子。此外，新冠病毒所檢測的各種指標，包括抗原、核酸、抗體等出現和峰值分布的時間也并不一致。比如，核酸檢測在病毒感染初期靈敏度較高；IgM抗體在感染早中期開始出現，滯后于核酸檢測靈敏度窗口期；IgG抗體在感染中后期才出現，檢測靈敏度高，但特異性較核酸、IgM檢測較低，一般用于出院的輔助判斷。目前，不管是中國新冠診療指南、美國FDA，還是WHO發布的文件，仍然將核酸檢測作為新冠病毒確診的金標準，而抗體檢測可以作為核酸檢測的重要補充。接下來，我們將對本次疫情中的一些主要體外檢測技術進行介紹。
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1. 核酸檢測方法學
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熒光定量RT-PCR
核酸檢測具有早期診斷、靈敏度和特異性高等特點，是確診新冠肺炎的“金標準”。首先需要對含有病毒的樣本進行滅活提取RNA，通過逆轉錄的方式獲得病毒的cDNA，然后通過一對和病毒基因組特定片段互補的引物進行PCR擴增，一般檢測位于病毒ORF1ab和N基因上的兩個靶標，同一份標本需要滿足雙靶標陽性或重復檢測為單靶標陽性或兩種標本同時滿足單靶標才能確認SARS-CoV-2病毒核酸陽性。核酸檢測樣本類型一般為鼻咽拭子、痰液、支氣管灌洗液和肺泡灌洗液。檢測程序經過取樣、留樣、保存、核酸提取、上級檢測等一系列步驟。
此處的“熒光”表示在PCR反應過程中引入熒光示蹤物1.加入能夠指示DNA片段擴增過程的熒光染料（SYBR Green等）或2.熒光標記的特異性探針（Taqman等），其熒光信號的積累與PCR產物的濃度有一定的換算關系。在PCR過程中，儀器不斷記錄熒光信號，通過標準曲線法對未知模板進行定量分析。
圖2.SYBR GREEN和TAQMAN探針QPCR原理（圖源：WILEY ONLINE LIBRARY）
優點：熒光定量PCR技術引入國內已久，技術普及程度較高，各級醫院大多都具備成熟的PCR人員。在應對疫情時，有足夠的場地、設備、人員進行檢測；對于復工、復學篩查，大量的第三方醫學檢驗中心也具備承接大量醫療器械創新網委托的能力。從操作層面上來講，熒光定量PCR上機后2小時即可拿到結果，靈敏度、特異度、準確度較高，有利于實現本次疫情中盡早診斷、盡早隔離、盡早干預的防疫方案。另一方面，國內在分子診斷領域已有諸多發展較為成熟的試劑廠家，具有成熟的研發、生產、質控、服務等經驗，可快速在短時間內研發并保證大量試劑、服務的供應。
缺點：熒光定量PCR檢測全過程步驟較多，操作時間較長，對于場地、人員有較高的要求。由于采樣不當（采樣位置，旋轉拭子，擦拭次數）、標本保存不當（2-8攝氏度保存）容易造成“假陰性”而漏診。另外，由于操作不規范，也可能引起樣本污染導致的“假陽性”。
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數字PCR（ddPCR）
數字PCR可以做到對目標核酸序列的定量和定性檢測，將具有熒光定量PCR的反應物（Taqman探針或SYBR Green引物）加載到液滴式微流控芯片上，然后用ddPCR擴增儀進行擴增。在反應完成后可通過成像分析，輸出原始數據，并經由軟件分析得到最終結果。ddPCR以qPCR為基礎，但可以做到絕對定量。即，將一個標準的qPCR反應分配到大量微小的反應器中（反應單元），每個反應器中包含1個或多個拷貝的目標分子（DNA模版），實現“單分子模版PCR擴增”反應。在反應結束后，通過判別“陽性”和“陰性”反應器結果，利用泊松分布原理進行統計分析，通過讀取陽性反應單元的個數及比例從而得出靶分子的起始拷貝數或濃度。根據反應單元的不同形式，主要可分為微板式、微腔式和微滴式三大類系統。
微滴式ddPCR在技術原理、通量和反應單元數等方面均優于微腔式（芯片式），更符合實際應用需求，設備包括微滴生成儀、微滴反應儀和微滴檢測儀三個部分，目前越來越多的廠家逐漸將其組分進行整合，以形成ddPCR的一步操作。另外，各大ddPCR體外診斷廠家也針對樣本前處理、核酸提取、反應體系混合等研發了全自動的解決方案。后續在同一張芯片耗材上進行多重標記物擴增或增加加樣通道等可增加ddPCR單次的檢測效率與檢測通量。
圖3.微滴式ddPCR原理（圖片來源：LabMedica）
優點：ddPCR可以克服qPCR檢測不出低拷貝靶分子、細微模版濃度差異、復雜背景下稀有突變的缺點，可做到極高的靈敏度和精確度，其樣本制備和擴增的時間與qPCR大體相同，但是由于其靈敏性，其樣本來源更加廣闊，并且對于病原體檢測有巨大的優勢。
缺點：正由于ddPCR對于低拷貝數也能檢出，因而對于可能的樣本污染必須特別小心，環境中的一丁點污染都有可能在實際過程中檢出。在一體化檢測方案出現之前，操作步驟和檢驗步驟較為復雜，對檢驗師要求較高。另外，較高的背景降噪技術與熒光陽性判讀算法對于ddPCR的精準度非常重要。
??核酸等溫擴增技術
?? ???近年新發展起來的核酸等溫擴增技術，在實際操作或儀器要求方面都比PCR技術更為簡單方便。新興的等溫擴增技術包括環介導等溫擴增、鏈替代等溫擴增、滾環等溫擴增、依賴解旋酶等溫擴增、依賴核酸序列等溫擴增、單引物等溫擴增和核酸快速等溫檢測放大等技術。
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?環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermalamplification, LAMP）
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?? LAMP是Notomi et al.于2000年提出來的一種新的核酸擴增技術，其原理主要是基于靶基因3'和5'端的6個區域設計3對特異性引物，包括1對外引物、1對環狀引物和1對內引物，3種特異引物依靠鏈置換BstDNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成不停地自我循環，從而實現快速擴增。反應1h后可根據擴增副產物焦磷酸鎂沉淀形成的濁度或者熒光染料進行判斷擴增情況。此反應先形成啞鈴狀模板，進入循環擴增階段，再進行伸長、循環擴增，共3個階段。
圖4.LAMP原理（圖源：Research Gate）
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依賴核酸序列的擴增?(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)
依賴核酸序列的擴增技術?(NASBA) 是 1991 年由加拿大 Can-gene 公司首次介紹。它是一項以核酸序列中 RNA為模板，由兩個引物介導的、連續均一的特異性體外等溫擴增核苷酸序列的酶促過程。整個反應由非循環相和循環相組成: 首先進行非循環相，在AMV 逆轉錄酶的作用下，引物 I 與模板 RNA 退火后合 成 cDNA，形 成 RNA/DNA 雜 合 體，隨 即RNaseH 降解 RNA，引物Ⅱ與 cDNA 退火，合成第二條 DNA 互補鏈。形成的 DNA 雙鏈由 T7 RNA 聚合酶識別啟動子序列，催化合成 RNA，進入循環相，對模板進行大量擴增。
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圖5.NASBA原理（圖源：//www.premierbiosoft.com/tech_notes/NASBA.html）
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滾環擴增技術?(Rolling circle amplification, RCA)
1998 年建立的滾環擴增 (RCA) 是模擬自然界微生物環狀 DNA 的滾環復制過程，發展起來的一種放大信號和靶核酸相結合的檢測方法。在具有鏈置換活性的 DNA 聚合酶作用下由一條引物與環形 DNA 模板的鏈置換合成，實現環狀 DNA 模板的體外等溫線性擴增。可分為線性擴增 (單引物 RCA)、指數擴增、多引物擴增和信號擴增RCA。
圖6.多種RCA原理（圖源：Chemical Society Reviews）
圖7.RCA擴增產物的多元化檢測手段（圖源：Chemical Society Reviews）
4、單引物等溫擴增技術(Single primer isothermal amplification，SPIA)
SPIA的核心是一條混合引物及可以切割DNA/RNA雜合鏈中RNA部分的RNA酶，由3'端DNA部分和5'端RNA部分組成。在反應過程中，RNaseH不斷降解引物區DNA/RNA雙鏈中的RNA部分，暴露出模板上與引物RNA部分結合的位點，然后新引物結合上去進行鏈置換合成，經過RNA降解、新引物結合、鏈置換的循環過程，實現模板互補序列的快速擴增。
圖8.SPIA擴增原理（圖源：Springer）
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依賴解旋酶?DNA等溫擴增技術(Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA)
依賴解旋酶 DNA 等溫擴增技術 (HDA) 是美國NEB 公司于 2004 年發明的一種新型核酸等溫擴增技術。該技術模擬體內 DNA 復制的自然過程，利用解旋酶在恒溫下解開 DNA 雙鏈，再由 DNA 單鏈結合蛋白穩定已解開的單鏈為引物提供模板，然后在 DNA 聚合酶的作用下合成互補的雙鏈，繼而不斷重復上述循環擴增過程，最終實現靶序列的指數式增長。
圖9.HDA擴增原理（圖源：Research Gate）
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重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)
RPA技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37攝氏度左右。
圖10.RPA擴增及檢測原理（圖源：Research Gate）
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鏈替代擴增?(Strand displacement amplification，SDA)
鏈替代擴增?(SDA) 技術最早是由 Walker等人于 1992 年在 《美國國家科學院匯刊》中進行了介紹，這是一種基于酶促反應的 DNA 體外等溫擴增技術，主要利用限制性內切酶剪切 DNA 識別位點的能力和 DNA 聚合酶在切口處向 3'延伸并置換下游序列的能力，在等溫條件下進行擴增。整個過程由準備單鏈 DNA 模板、生成兩端帶酶切位點的目的 DNA 片段、SDA 循環擴增 3 個步驟組成。
圖11.SDA擴增原理（圖源：Research Gate）
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切口酶擴增（Nicking enzyme amplification reaction, NEAR）
NEAR是2000年成立的Ionian Tech的技術，在2010年被Alere收購，Alere在2017年被雅培收購。反應體系中包括三種酶：反轉錄酶、恒溫擴增酶（Bst）、切口酶（Nicking enzyme）。上下游引物在恒溫擴增酶作用下對靶序列進行鏈置換擴增，切口酶可識別特定序列切下8-16個堿基單鏈后，形成缺口。缺口可利用恒溫擴增的DNA聚合酶繼續合成短序列。在60攝氏度下，合成的短序列自動解旋，成為恒溫擴增酶的進一步模版。新合成的短序列單鏈之后與帶有熒光的引物結合，從而通過熒光來定量分析。當熒光達到一定的強度，認定相應的病毒DNA達到一定含量。
圖12.NEAR擴增及檢測原理（圖源：ACS Publications）
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無論通過上述任何核酸等溫技術，都可以通過在擴增產物上添加熒光染料、使用熒光標記探針、通過反應產生的能量激發luciferase等熒光素酶等進行顯色，通過讀取熒光或層析的方式來實現定性檢測。
優點：速度快（半小時內出結果）、靈敏度高（初始只需要數百個病毒拷貝）、操作簡單、對于儀器要求低（只需要1個恒溫模塊和1個熒光收集模塊）。??缺點：短序列的設計存在高假陽性的可能，只能判斷陰陽性，無法定量。目前僅有有限的廠家應用部分核酸等溫擴增技術進行商業化試劑盒開發，還處在轉化的初級階段。難以適應野外、缺少供電、環境污染高等的場景。
2.CRISPR方法學
CRISPR全稱是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇的規律間隔的短回文重復序列），而Cas的全稱是CRISPR associated（CRISPR關聯）。CRISPR/Cas系統是一種原核生物的免疫防御系統，用來抵抗外來遺傳物質的入侵，比如噬菌體病毒等。同時，它為細菌提供了獲得性免疫（類似于哺乳動物的二次免疫），當細菌遭受病毒入侵時，會產生相應的“記憶”。當病毒二次入侵時，CRISPR系統可以識別出外源DNA，并將它們切斷，沉默外源基因的表達，抵抗病毒的干擾。
其主要原理為當噬菌體病毒首次入侵細菌，病毒的雙鏈DNA被注入細胞內部。CRISPR/Cas系統會從這段外源DNA中截取一段序列作為外源DNA的“身份證”，然后將其作為新的間隔序列被整合到基因組的串聯間隔排列的“重復序列”，即CRISPR序列之中。在病毒再次入侵DNA時，表達產生CRISPR RNA（crRNA），同時CRISPR序列附近的保守蛋白編碼基因（成為Cas基因）可表達一種核酸酶（Cas酶），這種酶和crRNA共同作用，識別入侵病毒的DNA靶序列并進行切割，實現對入侵病毒的免疫應答。
CRISPR/Cas的強大之處在于，其可以對基因進行定點的精確編輯。在向導RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細胞基因組DNA（看成外源DNA）將被精確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿足幾個條件。第一，待編輯的區域附近需要存在相對保守的PAM序列（NGG）。第二，向導RNA要與PAM上游的序列堿基互補配對。最基礎的應用就是基因敲除。如果在基因的上下游各設計一條向導RNA（gRNA1，gRNA2），將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質粒一同轉入細胞中，gRNA通過堿基互補配對可以靶向PAM附近的目標序列，Cas9蛋白會使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。隨后生物體自身存在著DNA損傷修復的應答機制，會將斷裂上下游兩端的序列連接起來，從而實現了細胞中目標基因的敲除。如果在此基礎上為細胞引入一個修復的模板質粒（供體DNA分子），這樣細胞就會按照提供的模板在修復過程中引入片段插入（Knock-in）或定點突變（site-specific mutagenesis）。這樣就可以實現基因的替換或者突變。隨著研究的深入，CRISPR/Cas技術已經被廣泛的應用，除了基因敲除，基因替換等基礎編輯方式，它還可以被用于基因激活，疾病模型構建，甚至是基因治療。
目前已發現的CRISPR/Cas系統大體可分為兩類（如下圖），Class 1（包含了type I, III,?and IV），和Class 2（包含了type II和type V和type VI）。在Class1中, 對于外源基因組的剪切需要一個大的Cas蛋白復合物（由不止一種Cas蛋白組成）和引導RNA。在Class2中，對于外源基因的剪切只需要一個單一的剪切蛋白, 例如TypeII中的Cas9蛋白和TypeV中的cpf1蛋白。此外不同類型的CRISPR/Cas系統針對的靶標類型（DNA或RNA）以及是否需要crRNA都不相同。
圖13.不同類型的CRISPR/Cas系統（圖源：//www.crispr.report/understanding-cas1-to-cas14-3/）
在本次新冠疫情檢測中，CRISPR/Cas技術創始發現的兩位鼻祖，MIT的張鋒團隊（SHERLOCK Biosciences）和UC Berkeley的Jennifer Doudna團隊（Mammoth Biosciences）分別使用SHERLOCK V2技術和DETECTR技術針對新冠病毒檢測開發了相應的檢測試劑。
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1、SHERLOCK V2
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MIT的張鋒團隊在2017年就開發出了基于CRISPR-Cas13a的檢測RNA技術，并稱為SHERLOCK(Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKingz)，該方法是通過引入人工設計的gRNA結合特異RNA序列后，Cas13a產生反式切割RNA。并且Cas13a在切割RNA后依然能夠保持“活躍”，繼續切割其他非目標RNA。研究人員利用這一“脫靶缺陷”，加入一種帶有RNA的熒光標記物，當標記物被切開時，會發出熒光信號而顯示檢測結果。2018年公開的新技術被稱為SHERLOCK v2，與SHERLOCK相比，通過引入等溫核酸擴增技術以及Type III CRISPR中的Csm6酶，其靈敏度提高了100倍，同時由于引入了多種來自不同種屬細菌的Cas13酶，該方法能在同一樣品中檢測出多種病毒感染，例如能同時檢出寨卡和登革熱病毒。在抗擊疫情中，張鋒團隊采用SHERLOCK V2方法開發出了配套試紙，在短時間內顯示出檢測結果，成本只要幾美元。該方法用時約1小時（擴增25分鐘、切斷反應30分鐘、試紙檢測2分鐘），檢出限可達每微升10拷貝。
圖14. SHERLOCK V2對于多重病原體檢測原理（圖源：Science）
圖15. SHERLOCK檢測新冠病毒試紙條（圖源：Feng Zhang et al. A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics）
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2、DETECTR??
UC Berkeley的Jennifer Doudna教授發現CRISPR/Cas12a系統在剪切靶向的dsDNA時其核酸酶活性會被激活，進而可以非特異性的切割ssDNA。因此，如果反應體系中存在針對某種病毒的靶向dsDNA，并引入非特異性熒光標記的報告ssDNA，CRISPR/Cas12a系統一旦檢測到目標DNA，就會誘發核酸酶活性，從而熒光報告基因也會被降解，從而釋放出熒光信號。該技術被稱為DETECTR（DNA Endonuclease-targeted CRISPR Trans Reporter）。
圖16. DETECTR技術檢測dsDNA原理（圖源：hhmi）
圖17. SHERLOCK和DETETR技術對比（圖源：//blog.addgene.org/finding-nucleic-acids-with-sherlock-and-detectr）
優點：由于CRISPR/Cas系統的多元性，以及和等溫核酸擴增的結合，可實現RNA和DNA分子的自由轉換，因而對于RNA或DNA病毒皆可開發出相應的檢測手段、試劑。CRISPR方法速度快（1小時內出結果）、靈敏度高（初始只需要數十個病毒拷貝）、操作簡單、對于儀器要求低（只需要1個恒溫模塊，可能需要1個熒光收集模塊）、單樣本檢測成本在1美元左右。
缺點：仍需要擴增，在野外、缺少供電或條件較差的環境較難使用，目前具備開發此類試劑的企業較少，技術在行業中處于轉化的初期階段。
3. 抗體方法學
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抗原檢測
抗原檢測指針對病原體的抗原（一般是病原體表面蛋白，有些用內部核蛋白），采用免疫學的方法進行檢測?？贵w識別和結合抗原上的某個表位（或抗原決定簇），如果這個表位序列與其他非靶點蛋白的某段序列或表位相似，則可能造成抗體與非靶點蛋白結合，這稱為交叉反應。交叉反應是免疫反應普遍存在的一種現象。
圖18.交叉反應原理（圖片來源于網絡，侵刪）
圖19. 新冠抗原快速檢測原理（圖片來源于網絡，侵刪，嘉樂資本整理）
優點：基于雙抗夾心法開發的快速診斷試劑特異性高、檢測速度快（10-15分鐘）、對儀器無依賴、操作簡便、假陽性低，因而適用于現場的快速檢測。由于該方法對前期樣本制備要求低，抗原蛋白又相對穩定，相對于核酸檢測來說臨床穩定性高。
缺點：對于較低的抗原濃度可能檢測下限要求比較難達到。
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抗體檢測法
《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中，將患者 的血清學指標即針對新冠病毒的特異性抗體IgM或IgG陽性作為診斷標準之一，這種方法稱為抗體檢測法，即使用抗抗體檢測患者的免疫系統針對新冠感染產生抗體的一種檢測。
靈長類動物主要有四種免疫球蛋白IgM、IgG、IgA和IgE。IgM是抗原刺激誘導體液免疫應答中最先產生的Ig，可結合補體，誘導高效的殺菌、溶菌、促吞噬和凝集作用。IgG是初級免疫中最持久、重要的抗體，在抗感染中起到主力軍作用，能夠促使單核巨噬細胞進行吞噬作用，可中和細菌毒素的毒性（中和毒素），也可與病毒抗原結合使病毒失去感染宿主細胞的能力（中和病毒）。IgA分為血清型和分泌型兩種，血清型IgA可介導調理吞噬ADCC作用，分泌型IgA是機體粘膜防御系統的主要成分。IgE主要與過敏反應相關。在人體對抗新冠病毒感染的過程中，IgM和IgG是“主力軍”。?抗體檢測法的原理利用了人體對病原體感染產生的天然反應。在病毒感染人體初期，人通常在7-10天內在血清中出現對該免疫原的特異性IgM抗體。如果血清中檢出病原體特異性IgM，則提示新發感染，機體內抗感染的“先頭部隊”已經激活。在感染發生20天左右，可以檢測到針對病原體的特異IgG抗體，表明患者處于感染中后期。如IgM/IgG雙陽，表明患者的免疫系統正與病毒進行搏斗。
圖20.人體在病原刺激后的體液免疫反應曲線（圖源：//www.vazymebiotech.com/products_detail/productId=267.html）
圖21.新冠病毒IgM/IgG快速檢測試劑盒使用流程
圖22.新冠病毒IgM/IgG快速檢測試劑盒結果判讀
除了膠體金、免疫層析等可開發快速檢測試劑的方法，新冠病毒IgM/IgG也可以使用酶聯免疫、化學發光、流式熒光等方法學進行檢測。這些技術平臺需要儀器輔助（流水線或者POCT），有的平臺還伴有全自動樣本處理、上級檢測一體化解決方案，適用于大批量樣本篩查，其檢測速度也可以和快速檢測相媲美。
圖23.常用的免疫診斷方法介紹（圖片來源于網絡，侵刪）
優點：在抗體檢測方法學中，較抗原檢測更容易研發和實現，靈敏度高，體內對病原發生免疫反應后即可檢測。便于開發快速檢測試劑盒，方便與現在IVD中較為成熟的技術平臺、POCT平臺進行結合。廠家具有開發此類產品較豐富的經驗，可以在疫情出現時，快速跟進研發、生產和銷售、使用，第一時間推向市場。
缺點：樣本中的干擾物質如類風濕因子、嗜異性抗體、補體、因使用鼠抗治療或診斷誘導的抗鼠Ig抗體等，樣本溶血、樣本被細菌污染、貯存時間過長、凝固不全等造成的檢測結果呈現假陽性。由于捕獲抗體（抗IgM/IgG）會結合血清中的任意IgM或IgG，該方法的特異性僅基于一對新冠抗原-抗體的特異性識別（因為捕獲的新冠特異IgM/IgG會結合新冠病毒抗原），因而在復雜樣本中，會產生非特異性結合而引起的假陽性。另外由于待檢人員血清中的IgM或IgG處于不同階段，可能會出現漏檢的問題。
圖24.新冠病毒實驗室診斷方法比較（抗原檢測vs.抗體檢測）(圖片來源于網絡，侵刪)
結語
?此次的新冠疫情對全世界的公共衛生體系應對能力以及相關的生物醫藥技術提出了嚴峻的挑戰。然而，此次我國對于疫情的響應速度還是很快的，在疫情出現明顯上升趨勢的極短時間內，新冠病毒的基因組信息即向全世界進行了公布。國內的IVD企業也在疫情出現的1個月內研發出了相關的檢測試劑盒，并不斷進行優化。目前我國研制的新冠檢測試劑盒已經遠銷海外，助力全球各國的抗疫行動。
在全球范圍內，各種診斷技術平臺、方法百花齊放，與不同的國家地區、應用場景相結合或不同的檢測方法之間相結合，有望在病毒感染人體的各個階段，進行損傷最小、依從性最高、速度最快、成本較低的精準判斷。同時，在針對新冠病毒疫苗治療手段研發如火如荼的進程中，新冠病毒體外診斷技術也將為評估療效、判斷預后貢獻一份巨大的力量。針對新冠疫情得以應用的新型體外診斷技術平臺也可擴展適用于其他感染病原體、腫瘤輔助診斷、精準用藥等項目，致力于我國IVD產業技術水平、服務質量的整體提升。
