體外診斷試劑產(chǎn)品注冊技術審評報告

產(chǎn)品中文名稱：胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒(可逆末端終止測序法)

產(chǎn)品管理類別：第三類

申請人名稱：北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司

國家藥品監(jiān)督管理局?

醫(yī)療器械技術審評中心

基本信息

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一、 申請人名稱

北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司

二、申請人住所

北京市大興區(qū)中關村科技園區(qū)大興生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)基地天榮街19號院6幢204室

三、生產(chǎn)地址

北京市大興區(qū)中關村科技園區(qū)大興生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)基地天榮街19號院6幢204室

技術審評概述

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一、產(chǎn)品概述

（一）產(chǎn)品主要組成成分

試劑盒具體組成成分、配套試劑見說明書。

（二）產(chǎn)品預期用途

本產(chǎn)品用于定性檢測試管嬰兒過程中體外培養(yǎng)胚胎的囊胚滋養(yǎng)層細胞的脫氧核糖核酸（DNA），通過對胚胎部分細胞的DNA進行檢測，分析胚胎染色體是否存在非整倍體數(shù)量異常，輔助臨床醫(yī)生判斷胚胎是否植入。

本產(chǎn)品適用于女性年齡38歲及以上進行試管嬰兒的患者；夫妻雙方或一方存在染色體異常的患者；三次以上的試管嬰兒植入失敗者；三次以上自然流產(chǎn)患者；生育過染色體異常患兒的夫婦。

檢測結果僅供參考，不單獨作為確診的依據(jù)，本產(chǎn)品不用于拷貝數(shù)變異的檢測。

（三）產(chǎn)品包裝規(guī)格

42測試/盒、96測試/盒

（四）產(chǎn)品檢驗原理

該試劑盒是利用全基因組擴增技術對從囊胚期胚胎獲得的細胞進行擴增，利用可逆末端終止高通量測序技術對擴增產(chǎn)物進行全基因組測序，通過生物信息軟件對測序結果進行數(shù)據(jù)分析，判斷胚胎是否存在染色體非整倍體異常。

胚胎細胞全基因組擴增通過低擴增偏好的方式進行，以盡可能無偏倚地保持樣本原始DNA信息。擴增分三步進行：裂解，預擴增和擴增。對胚胎細胞裂解后，使用具有特殊結構的隨機引物及配套組分對基因組進行預擴增，形成結構相對穩(wěn)定的預擴增產(chǎn)物，最后使用與預擴增引物的非隨機部分的序列匹配的擴增引物及配套組分對基因組進行指數(shù)擴增。

文庫構建時，對全基因組擴增產(chǎn)物進行片段化和接頭連接，采用PCR擴增的方法對片段化產(chǎn)物加入標簽序列并實現(xiàn)文庫的富集。最后，通過XP磁珠完成對文庫的純化，完成文庫構建。

該試劑盒結合可逆末端終止測序技術和生物信息學分析方法，基于新一代的高通量測序平臺，對胚胎囊胚期活檢細胞中染色體數(shù)目異常進行定性檢測。可逆末端終止測序技術的檢測過程包括：將不同熒光基團標記的四種脫氧核苷酸以及DNA聚合酶同時加入流動槽通道中，按堿基互補原理，合成互補的DNA鏈；在堿基延伸過程中，每個循環(huán)中合成反應只能延伸一個正確互補的堿基，根據(jù)四種不同的熒光信號確認堿基種類，讀取該次反應顏色后，堿基保護基團被除去，下一個反應可繼續(xù)進行；最終，通過對所有測序信號的分析，實現(xiàn)對DNA序列各個位點不同堿基的序列判定；并結合生物信息學分析方法，對人染色體所屬的DNA片段數(shù)量進行統(tǒng)計，將統(tǒng)計的結果與大量正常樣本構成的參考集合相比較，即可獲得檢測樣本中所含染色體DNA片段數(shù)量是否存在異常，從而實現(xiàn)對人胚胎23對染色體數(shù)目異常的判斷。

二、臨床前研究概述

（一）主要原材料

1.主要原材料的選擇

該試劑盒主要原材料包括：無核酸酶水、裂解液、裂解酶緩沖液、裂解酶、預擴增緩沖液、預擴增酶、擴增緩沖液、擴增酶、文庫構建試劑、PCR擴增試劑、標簽序列、測序試劑、流動槽、雜交緩沖液、PR2反應緩沖液及對照品等。這些原材料均為外購方式獲得，對照品由細胞供應商提供，并由申請人制備獲得。申請人對主要原材料進行了供應商選擇，通過功能性試驗，篩選出最佳的原材料供應商，制定了主要原材料質量要求并經(jīng)檢驗合格。

2.企業(yè)參考品和對照品設置情況

企業(yè)參考品包括陽性參考品、陰性參考品、嵌合體參考品、數(shù)據(jù)量控制參考品。陽性參考品20份，是由多種染色體非整倍體陽性細胞樣本組成；陰性參考品3份，是由染色體非整倍體陰性細胞樣本組成；嵌合體參考品6份，是由兩種不同染色體拷貝數(shù)變異樣本混合制備的細胞樣本組成；數(shù)據(jù)量控制參考品1份，由YH細胞樣本組成。

對照品是由2份陽性對照品和1份陰性對照品組成，用于檢測過程中試劑和儀器的質量控制。其中陽性對照品是由染色體非整倍體陽性細胞樣本（21三體和XO）組成；陰性對照品是由染色體非整倍體陰性細胞樣本組成。

（二）生產(chǎn)工藝及反應體系研究

申請人通過使用初步確定的配方進行反應體系配制，對反應體系中細胞裂解、預擴增、擴增、片段化、PCR擴增等步驟，對標簽序列、雜交緩沖液、PR2反應緩沖液、上機文庫濃度、樣本用量等關鍵步驟進行不同反應條件的篩選，確定了最優(yōu)的反應條件。通過功能性試驗和生產(chǎn)工藝研究，確定了最佳的生產(chǎn)工藝和反應體系。

（三）分析性能評估

分析性能評估內(nèi)容包括樣本穩(wěn)定性、樣本類型的研究分析、染色體非整倍體陽性符合率、微缺失微重復符合率、陰性符合率、嵌合體符合率、數(shù)據(jù)量控制、重復性、精密度、分析特異性。

1.樣本穩(wěn)定性研究：申請人對胚胎細胞樣本的儲存穩(wěn)定性、凍融次數(shù)進行了研究，最終確定細胞樣本-20±5℃保存時間不超過3個月；樣本反復凍融次數(shù)不超過1次。

申請人對細胞樣本的全基因組擴增產(chǎn)物儲存穩(wěn)定性進行了研究，最終確定全基因組擴增產(chǎn)物于-70±10℃或-20±5℃環(huán)境保存不超過2個月。

2.樣本類型研究：申請人對樣本用量進行了研究，細胞樣本的樣本用量為1～20個細胞時，均能夠滿足檢測要求。考慮臨床囊胚活檢樣本的可獲得性，最終確定適用于本產(chǎn)品的囊胚滋養(yǎng)層活檢樣本的細胞數(shù)目為3～10個。

3.染色體非整倍體陽性檢測符合率：對連續(xù)三批生產(chǎn)的試劑盒采用16份染色體非整倍體陽性樣本進行檢測，檢測結果表明染色體非整倍體陽性符合率為100%；使用國家參考品中的非整倍體陽性參考品檢測，符合率100%。

4.微缺失微重復檢測符合率：該產(chǎn)品對微缺失微重復的檢出情況進行了分析性能評估；使用國家參考品中的微缺失微重復參考品檢測，符合該指標。

5.陰性檢測符合率：對連續(xù)三批生產(chǎn)的試劑盒采用7份陰性樣本進行檢測，檢測結果表明陰性符合率為100%；使用國家參考品中的陰性參考品檢測，符合率? ?100%。

6.嵌合體檢測符合率：對連續(xù)三批生產(chǎn)的試劑盒采用6 ?份嵌合樣本進行檢測，檢測結果表明對30% 嵌合的嵌合體樣本符合率達到30%以上；70%嵌合體符合率達到60%以上；使用國家參考品中的嵌合體參考品檢測，符合該指標。

7.數(shù)據(jù)量控制檢測：對連續(xù)三批生產(chǎn)的試劑盒采用1份企業(yè)數(shù)據(jù)量控制參考品進行檢測，檢測結果表明數(shù)據(jù)量控制參考品的檢測有效數(shù)據(jù)量不低于1M，基因組覆蓋率不低于4%；使用國家參考品中的數(shù)據(jù)量控制參考品檢測，符合該指標。

8.重復性：對連續(xù)三批生產(chǎn)的試劑盒分別進行三次上述的染色體非整倍體陽性檢測符合率試驗、微缺失微重復檢測符合率試驗、陰性檢測符合率試驗、嵌合體檢測符合率試驗、數(shù)據(jù)量控制檢測試驗，檢測結果表明重復性均滿足技術要求規(guī)定的性能指標。

9.精密度：對連續(xù)三批生產(chǎn)的試劑盒采用企業(yè)參考品分別在兩個不同的實驗室、分別選用兩位不同的操作者在兩臺不同的測序儀進行檢測，每批試劑盒檢測三次，檢測結果表明不同實驗室間重復性、不同操作者重復性、不同測序儀重復性的檢測均滿足技術要求規(guī)定的性能指標。

10.分析特異性：對連續(xù)三批生產(chǎn)的試劑盒采用60份染色體

微缺失微重復樣本進行檢測，均未檢測出非整倍體；對三批生產(chǎn)的試劑盒采用9份已知存在染色體微缺失微重復的非整倍體樣本進行檢測，均檢測出應檢出的非整倍體；檢測結果表明分析特異性達到100%。

（四）陽性判斷值或參考區(qū)間研究

申請人采用已知染色體非整倍體陰性樣本構建參考數(shù)據(jù)庫，然后采用已知的染色體非整倍體陰性樣本及模擬數(shù)據(jù)建立參考范圍，并用400例已知核型樣本進行參考范圍的確定，最終確定的染色體非整倍體陰性樣本的染色體的檢測信號值（RCid）的參考范圍為12.97＜RCid＜26.97，染色體非整倍體陽性樣本的RCid的參考范圍為：RCid大于等于26.97或小于等于12.97。

具體過程如下，通過350例染色體非整倍體陰性樣本檢測數(shù)據(jù)和4400例染色體組成異常的模擬數(shù)據(jù)構建參考數(shù)據(jù)庫，計算其中每個樣本的24條染色體的RCid值，利用Z值法對Rcid值區(qū)間進行劃分，并使用該試劑盒對400例染色體非整倍體陰性樣本和染色體非整倍體陽性樣本進行驗證，從而最終確定參考值的范圍。

（五）試劑盒穩(wěn)定性研究

申請人對該試劑盒的長期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性進行了研究，確定了在各種條件下該試劑盒的有效保存時間。長期穩(wěn)定性試驗：取連續(xù)三批生產(chǎn)的試劑盒，將試劑盒置于儲存環(huán)境中，分別于第0、3、6、7個月取出，對試劑盒的性能指標進行檢測，確定該試劑盒在其儲存環(huán)境下的有效期為6個月。

開瓶穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性試驗：取連續(xù)三批生產(chǎn)的試劑盒，將試劑盒開瓶后置于儲存環(huán)境中，于0、1、2、3、4、5、6個月對試劑盒的性能指標進行檢測，同時，在整個穩(wěn)定性考察時，有效期內(nèi)的反復凍融次數(shù)為6次，考察產(chǎn)品經(jīng)過反復凍融后，其產(chǎn)品性能有無變化。最終確定該試劑盒開瓶后可以穩(wěn)定存放3個月，反復凍融≤5次。

運輸穩(wěn)定性試驗：取連續(xù)三批生產(chǎn)的試劑盒，將試劑盒按照儲存溫度要求采用冷鏈運輸，運輸時長為4天，分別于運輸前、退回公司后及有效期末對試劑盒的性能指標進行檢測，確定該試劑盒運輸時限為3天。

三、臨床評價概述

申請人在中信湘雅生殖與遺傳專科醫(yī)院、上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院、山東大學附屬生殖醫(yī)院、中國福利院國際和平婦幼保健院四家臨床試驗機構開展了臨床試驗。臨床試驗采用考核試劑與臨床參考方法進行比較研究的試驗方法，確認考核試劑的臨床有效性。考核試劑檢測陽性的胚胎，對比確認方法為FISH；考核試劑檢測陰性的胚胎，對比確認方法為染色體核型分析，包括產(chǎn)前診斷羊水、流產(chǎn)組織或新生兒臍帶血的核型分析。

臨床試驗共入組 1221 對符合適應癥的受試者，考核試劑共檢測4640 例胚胎，檢測出陽性胚胎樣本 1494 例，陰性胚胎樣本3135 例，11 例未獲得有效檢測結果。其中陽性樣本總共完成 632例 FISH 驗證，99 例陽性樣本由于未觀察到細胞樣本、檢測無結果或 FISH 試劑過期而脫落，共納入統(tǒng)計 533 例陽性胚胎。其中Chr13、Chr16、Chr18、Chr21 以及性染色體陽性驗證例數(shù)為：Chr13（59 例）、Chr16（53 例）、Chr18（41 例）、Chr21（61 例）、 性染色體（47 例）；陰性胚胎樣本有 1058 例進行了植入，569 例 成功妊娠，獲得 231 例核型分析檢查結果（其中羊水穿刺核型分析222例，流產(chǎn)組織核型分析1例，因方案偏離等原因剔除8例），共納入223例陰性胚胎。

通過對以上共533例FISH確認的陽性樣本以及223例核型分析確認的陰性樣本統(tǒng)計分析，待考評試劑盒的靈敏性為100%（95%CI：99.3%～100%），特異性為98.2%（95%CI：95.6%～99.5%）。陽性預測值為99.2%(95%CI：98.1%～99.8%)，陰性預測值為100.00%(95%CI：98.4%～100.00%)。由于本臨床試 驗無法對所有陰性樣本以及陽性樣本全部進行驗證的特點，通過 對受試者的基線特征和入組胚胎的基線特征進行分析，發(fā)現(xiàn)受試者基線和入組胚胎基線在已驗證與未驗證樣本中均不具有顯著差 異，可以認為在本產(chǎn)品檢測結果的統(tǒng)計中，完成驗證的樣本能夠 代表總體樣本。

根據(jù)2002年衛(wèi)生部頒發(fā)的《胎兒染色體核型分析技術規(guī)范》要求核型分析的準確率不低于98%。對已完成驗證的樣本進行統(tǒng)計分析，得出本產(chǎn)品總符合率為99.5%；利用基于二項分析的統(tǒng)計算法得出所有樣本的陽性預測值為99.2%，陰性預測值為100.0%，因此參考上述規(guī)范的要求，可認為該產(chǎn)品達到了臨床診斷的準確性要求。

綜上所述，該產(chǎn)品臨床試驗資料對產(chǎn)品的臨床性能進行了全面研究，臨床試驗結果基本符合臨床應用要求。申請人需在該產(chǎn)品上市后進一步完成以下工作：上市后需繼續(xù)搜集至少10家臨床機構、全部臨床使用數(shù)據(jù)作為臨床補充資料在產(chǎn)品下一次延續(xù)注冊時提交，繼續(xù)收集各染色體檢測異常情況（本試劑檢測陽性）及植入后（本試劑檢測陰性）結果情況，植入后的胚胎繼續(xù)追蹤其與臨床參考方法的檢測結果（核型分析/出生隨訪）的對比情況。該項臨床資料應當由出具數(shù)據(jù)各臨床機構簽章。

四、產(chǎn)品收益風險判定

根據(jù)“YY/T0316-2016醫(yī)療器械風險管理對醫(yī)療器械的應用”標準，對該產(chǎn)品進行風險分析。

（一）受益評估

本產(chǎn)品用于定性檢測試管嬰兒過程中體外培養(yǎng)胚胎的囊胚滋養(yǎng)層細胞的脫氧核糖核酸（DNA），通過對胚胎部分細胞的DNA進行檢測，分析胚胎染色體是否存在非整倍體數(shù)量異常，輔助臨床醫(yī)生判斷胚胎是否植入。本產(chǎn)品適用于女性年齡38歲及以上進行試管嬰兒的患者；夫妻雙方或一方存在染色體異常的患者；三次以上的試管嬰兒植入失敗者；三次以上自然流產(chǎn)患者；生育過染色體異常患兒的夫婦。上述人群是胚胎染色體非整倍體高發(fā)人群，通過檢測結果來輔助判斷胚胎是否植入，減少因植入異常胚胎而造成的反復種植失敗、反復流產(chǎn)、出生缺陷等，減少患者生理、心理傷害及社會經(jīng)濟負擔。

（二）風險評估

該試劑盒檢測結果會受到樣本來源、樣本采集過程、樣本運輸條件等樣本因素的影響，同時也受到試驗操作、試驗環(huán)境、試劑儲存等試驗因素的影響，可能導致數(shù)據(jù)質量降低或檢測失敗。使用者須了解檢測過程中可能存在的潛在風險及檢測的局限性，詳見產(chǎn)品說明書中【檢驗方法的局限性】。

不符合該試劑盒說明書中【樣本要求】的樣本或不恰當?shù)脑囼灢僮鲿е聰?shù)據(jù)質量降低或檢測失敗，請嚴格按照產(chǎn)品說明書中【樣本要求】及【檢驗方法】的要求操作和進行試驗過程質控。

該試劑盒在檢測過程中涉及基因擴增，在非可控的實驗室操作可能由于環(huán)境中氣溶膠的存在導致結果不可靠，同時PCR操作過程中氣溶膠的泄露可能會導致設備甚至實驗室的污染。因此，請在可控的實驗室進行檢測操作，操作人員必須進行專業(yè)培訓，嚴格按照說明書操作。

在現(xiàn)有技術條件下，該產(chǎn)品檢測結果僅輔助醫(yī)生判斷胚胎是否植入，胚胎植入后還將按照體外輔助生殖相關診療規(guī)程對植入胚胎的情況進行產(chǎn)前檢測和產(chǎn)前診斷等。

（三）受益-風險的確定

通過環(huán)境控制、生產(chǎn)監(jiān)控、成品檢驗和增加說明書警示內(nèi)容等防范措施，對該試劑盒的已知和可預見的安全風險進行控制和降低，剩余風險可以被控制在可接受范圍內(nèi)，同時沒有帶來新的危害與安全風險。在目前認知水平上，認為該試劑盒上市帶來的受益大于風險。盡管目前認為該試劑盒的受益大于風險，但是為保證用械安全，基于對主要剩余風險的防控，已在該試劑盒說明書中提示以下信息：

1.預期用途：該試劑盒適用于女性年齡38歲及以上進行試管嬰兒的患者；夫妻雙方或一方存在染色體異常的患者；三次以上的試管嬰兒植入失敗者；三次以上自然流產(chǎn)患者；生育過染色體異常患兒的夫婦。

2.警示及注意事項：該試劑盒說明書中明確了該試劑盒【檢驗方法的局限性】及使用中的【注意事項】。

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綜合評價意見

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本申報項目為境內(nèi)第三類醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊，屬于創(chuàng)新醫(yī)療器械（編號：201600088）。申請人的注冊申報資料符合現(xiàn)行要求，依據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》（國務院令第680號）、《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令2014年第5號）等相關醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經(jīng)系統(tǒng)評價后，建議準予注冊。申請人在該產(chǎn)品上市后需繼續(xù)搜集至少10家臨床機構、全部臨床使用數(shù)據(jù)作為臨床補充資料在產(chǎn)品下一次延續(xù)注冊時提交，繼續(xù)收集各染色體檢測異常情況（本試劑檢測陽性）及植入后（本試劑檢測陰性）結果情況，植入后的胚胎繼續(xù)追蹤其與金標準檢測結果（核型分析/出生隨訪）的對比情況。該項臨床資料應當由出具數(shù)據(jù)各臨床機構簽章。?

附件：產(chǎn)品說明書

胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒

（可逆末端終止測序法）說明書

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【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（可逆末端終止測序法）?

【包裝規(guī)格】

?42 測試/盒、96 測試/盒

【預期用途】

本產(chǎn)品用于定性檢測試管嬰兒過程中體外培養(yǎng)胚胎的囊胚滋養(yǎng)層細胞的脫氧核糖核酸（DNA），通過對胚胎部分細胞的DNA進行檢測，分析胚胎染色體是否存在非整倍體數(shù)量異 常，輔助臨床醫(yī)生判斷胚胎是否植入。本產(chǎn)品適用于女性年齡38歲及以上進行試管嬰兒的患 者；夫妻雙方或一方存在染色體異常的患者；三次以上的試管嬰兒植入失敗者；三次以上自然流產(chǎn)患者；生育過染色體異常患兒的夫婦。

?染色體非整倍體是指單個染色體或多個染色體數(shù)目的增加或減少，是臨床上最常見的染色 體數(shù)目異常。試管嬰兒體外受精的胚胎中容易發(fā)生染色體非整倍體異常，異常胚胎植入女性子宮 可導致種植失敗、流產(chǎn)、出生缺陷等問題，通過胚胎植入前染色體非整倍體異常檢測（PreimplantationGeneticTestingforAneuploidies,PGT-A）可以減少植入染色體數(shù)目異常的胚胎，減 少因植入異常胚胎而造成的反復種植失敗、反復流產(chǎn)、出生缺陷等。臨床常見的染色體非整倍體 檢測技術包括熒光原位雜交技術（FluorescenceInSituHybridization,FISH），微陣列比較基因組雜交 技術(ComparativeGenomicHybridization,Array-CGH)，單核苷酸多態(tài)性芯片檢測技術（Single NucleotidePolymorphism,SNP-Array）。

檢測結果僅供參考，不單獨作為確診的依據(jù)，本產(chǎn)品不用于拷貝數(shù)變異的檢測。?

【檢驗原理】

人類早期胚胎會發(fā)生較高頻率的染色體異常，其中以染色體非整倍體最常見。通過高通量 測序技術對胚胎細胞染色體DNA進行檢測，利用生物信息學方法對檢測結果進行分析，最終可 以獲得胚胎細胞中染色體數(shù)目的信息。本試劑盒對囊胚期活檢細胞樣本（3~10個）進行全基因組 擴增，實現(xiàn)DNA模板從pg級到μg級的均一性放大與富集。接著，對全基因組擴增產(chǎn)物進行片段 化和接頭連接。然后，采用PCR擴增的方法對片段化產(chǎn)物加入標簽序列并實現(xiàn)文庫的富集。使用 XP磁珠完成對文庫的純化，獲得片段大小為200~700bp的文庫分子；對文庫進行測序和數(shù)據(jù)分析，即可獲得胚胎細胞中23對染色體數(shù)目異常的信息。

胚胎細胞全基因組擴增通過低擴增偏好的方式進行，以盡可能無偏倚地保持樣本原始DNA信息。擴增分三步進行：裂解，預擴增和擴增。對胚胎細胞裂解后，使用特殊結構的隨機引物及配套組分對基因組進行預擴增，形成結構相對穩(wěn)定的預擴增產(chǎn)物，最后使用與預擴增引物的非隨 機序列匹配的擴增引物及配套組分對基因組進行指數(shù)擴增。

?本試劑盒結合可逆末端終止法高通量測序技術和生物信息學分析方法對胚胎囊胚期活檢細 胞中染色體數(shù)目異常進行定性檢測。可逆末端終止測序技術的檢測過程包括：將不同熒光基團標 記的四種核苷酸以及DNA聚合酶同時加入流動槽通道中，按堿基互補原理，合成互補的DNA 鏈；在堿基延伸過程中，每個循環(huán)反應只能延伸一個正確互補的堿基，根據(jù)四種不同的熒光信號 確認堿基種類，讀取該次反應顏色后，堿基保護基團被除去，下一個反應可繼續(xù)進行。最終，通 過對所有測序信號的分析，實現(xiàn)對DNA序列各個位點不同堿基的序列判定；并結合生物信息學 分析方法，對人類染色體所屬的DNA片段數(shù)量進行統(tǒng)計，將統(tǒng)計的結果與大量正常樣本構成的 參考集合相比較，即可獲得檢測樣本中所含染色體DNA片段數(shù)量是否存在異常的信息，從而實 現(xiàn)對人類23對染色體數(shù)目異常的判斷，為臨床上選擇健康正常的胚胎提供輔助判斷。

【主要組成成分】

說明：不同批號試劑盒中各組份不可以互換。

自備試劑及儀器：?

1. ? AgencourtAMPureXPkit（BeckmanCoulter貨號：A63882）

2. ? QubitTMFluorometer（LifeTechnologies貨號：Q33218）

3.??QubitTMdsDNAHSAssayKits或QubitTM1×dsDNAHSAssayKits（LifeTechnologies貨號：Q33231）

4. ? QubitTMassaytubes（LifeTechnologies貨號：Q32856）?

5.胚胎染色體異倍體分析系統(tǒng)（北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司，版本號：V1.01，醫(yī)療 器械注冊證書編號：）

【儲存條件及有效期】

1.試劑盒A部分于-20±5℃保存：試劑盒B部分于2-8℃保存。

2.未拆封試劑盒在上述儲存條件下有效期為6個月，試劑盒中冷凍保存組分可允許的凍融 次數(shù)≤5次，建議開封后的試劑盒在3個月內(nèi)使用完畢。?

【適用儀器】

MiSeqDx基因測序儀（Illumina）?

【樣本要求】

1.樣本類型：

囊胚期滋養(yǎng)層細胞活檢樣本。?

2.樣本采集：

樣本的采集：按照《體外受精-胚胎移植實驗室技術》（人民衛(wèi)生出版社，2012.2）中“11.4.4 囊胚滋養(yǎng)層細胞活檢”來操作，細胞采集數(shù)3-10個。在顯微鏡下，將活檢后的胚胎細胞使用新鮮 培養(yǎng)基洗滌2次，再使用PBS緩沖液洗滌3次，然后將洗滌后的細胞（約含0.5μL1×PBS緩沖液） 小心轉移至裝有2.0μL1×PBS緩沖液的PCR管中。

3.樣本保存：

-20±5℃保存時間不超過3個月；樣本反復凍融次數(shù)不超過1次。應盡快進行擴增。

4.樣本運輸：

干冰條件下運輸；須確保樣本送達時有足夠的剩余干冰，且有緩沖裝置，避免樣本管在運 輸過程中被干冰冰塊擠破。

【檢驗方法】?

1.??? 全基因組擴增

1.1細胞裂解

1)??? 將細胞樣本冰上解凍并瞬時離心30s，用1×PBS緩沖液補至2.5μL，同時用2.5μL1×PBS緩 沖液作為擴增的空白對照；

2)??? 向細胞樣本及空白對照中加入2.5μL的裂解液，瞬時離心，置于冰盒上；

3)??? 根據(jù)下表，在離心管中依次加入試劑，對裂解酶進行稀釋，并使用移液器反復吹打混勻， 置于冰盒上；

向細胞樣本、空白對照管以及對照品管中加入5μL上一步制備的細胞裂解液混合物，瞬時離 心（禁止振蕩）；

注意：對照品包括對照品1、對照品2、對照品3

4)??? 在PCR儀上，按以下條件進行反應：75℃10分鐘，95℃4分鐘，25℃保持。?

1.2預擴增

1)??? 根據(jù)下表，制備全基因組預擴增混合物，并使用移液器反復吹打混勻；

2)??? 向1.1制備的裂解物加入5μL上一步制備的全基因組預擴增混合物，瞬時離心；

3)??? 在PCR儀上，按以下條件進行反應：95℃2分鐘；

95℃ 15秒，15℃50秒，25℃ 40秒，35℃30秒，65℃40秒，75℃40秒；4℃保持；

4)??? 將全基因組預擴增產(chǎn)物置于冰盒上。

1.3擴增

1)??? 根據(jù)下表，制備全基因組擴增混合物，并使用移液器反復吹打混勻；

2)??? 向1.2制備的全基因組預擴增產(chǎn)物中加入上一步制備的全基因組擴增混合物，顛倒混勻，瞬時離心；?

3)??? 在PCR儀上，按以下條件進行反應：95℃2分鐘；

95℃15秒，65℃1分鐘，75℃1分鐘；4℃保持；

? ? ? ? ? ? ? 14個循環(huán)

?4)??? 反應結束立即將樣本從PCR儀上取出，將擴增產(chǎn)物置于冰盒上，直至進行下一步操作。

5)??? 擴增產(chǎn)物-20±5℃保存不超過2個月。?

1.4全基因組擴增產(chǎn)物的質量控制

1.4.1全基因組擴增產(chǎn)物的濃度測定：濃度測定采用Qubit?Fluorometer系統(tǒng)，檢測試劑為QubitTM

雙鏈DNA高靈敏度檢測試劑盒，具體操作步驟參照產(chǎn)品說明書。細胞樣本及對照品的濃度范圍為

20-80ng/μL；如果空白對照的濃度＜8ng/μL，表明空白對照質量合格，將細胞樣本及對照品按照2、

3、4和5步驟進行文庫構建、測序和數(shù)據(jù)分析；如果空白對照的濃度≥8ng/μL，可對空白對照進一步進行人類基因組比對率（mapratio）質量評價，按照1.4.2步驟進行操作。

1.4.2對1.4.1步驟中濃度≥8ng/μL的空白對照擴增產(chǎn)物分別按照2、3、4和5步驟進行文庫構建、 測序和數(shù)據(jù)分析，測序人類基因組比對率（map ratio）值應不高于50%。

??

2.??? 文庫構建

2.1? ?擴增產(chǎn)物片段化和標記

1)??? 預先取出轉座酶混合液和轉座酶緩沖液，將其置于冰盒上，融化后充分振蕩混勻，瞬時離 心；將轉座中和液恢復到室溫，振蕩混勻并確保沒有沉淀；

2)??? 將全基因組擴增產(chǎn)物稀釋至0.2ng/μL，渦旋振蕩15秒，瞬時離心；

3)??? 根據(jù)下表在0.2mLPCR管中依次加入試劑，并用移液器吹打混勻；

4)??? 將上步反應液振蕩混勻15秒，瞬時離心，在PCR儀上按以下條件進行反應：

55℃ 5分鐘；10℃保持；

5)??? 當反應達到10℃時，取出反應管立即加入5μL轉座中和液，振蕩混勻15秒，瞬時離心，室溫放置5分鐘。

2.2????? PCR擴增

1)??? 預先取出PCR擴增試劑和標簽序列，室溫融化后充分振蕩混勻，瞬時離心；

2)??? 根據(jù)下表，在上一步片段化反應管中依次加入以下試劑；

?

3)??? 將反應液振蕩混勻15秒，瞬時離心，在PCR儀上按以下條件進行反應：

72℃ 3分鐘；95℃ 30秒，95℃ 10秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒；72℃5分鐘，4℃保持。

提示：

????? 加入標簽序列時須反復核對

????? 每次只打開一個管蓋，謹防標簽序列交叉污染

2.3????? PCR產(chǎn)物純化

1)??? 預先取出AMPureXP磁珠，室溫平衡30分鐘，渦旋振蕩1分鐘，充分混勻；

2)??? 按樣本量配制80%的乙醇（80%乙醇須新鮮配制，配制量為500μL/樣本），顛倒混勻；

3)??? PCR反應結束后，取出PCR管，瞬時離心，加入50μL磁珠，渦旋振蕩5秒，靜置5分鐘，瞬 時離心，再置于磁力架上靜置至液體澄清，小心吸棄上清；

4)??? 加入200μL新鮮配制的80%乙醇，慢慢轉動離心管兩圈，讓磁珠滾動起來，再將離心管置于 磁力架上靜置，待液體澄清后，小心吸棄上清；

5)??? 重復步驟4）1次，進行第2次乙醇洗滌；

6)??? 將離心管從磁力架上取出，瞬時離心，再放回磁力架上，用移液器將殘余的乙醇吸走，敞開管蓋，室溫晾干≤5分鐘；

重要提示：

????? 如磁珠過濕須延長室溫晾干時間

????? 避免磁珠過度干燥，如磁珠有裂紋出現(xiàn)須蓋好管蓋，并立即進行下步試驗操作

7)??? 將離心管從磁力架上取出，加入30μLDNA重懸液，吹吸5~10次將磁珠完全懸浮，渦旋振蕩5秒，靜置5分鐘，瞬時離心。將離心管放置于磁力架上靜置至澄清，吸取全部上清轉移到1.5mL管中，即為純化好的文庫。

注意：不要吸取磁珠。

8)??? 用Qubit方法測定文庫濃度，具體操作方法見操作步驟1.4；文庫濃度不得低于0.6ng/μL。

3.??? 測序模板制備

3.1? ?混合文庫

1)??將文庫稀釋到2nM，稀釋倍數(shù)=文庫濃度（ng/μL）×1515/450÷2(nM)，具體操作如下：

稀釋后渦旋振蕩15秒，瞬時離心；

2)? ?將每個稀釋至2nM的文庫各取5μL加入至同一個1.5mL離心管中，渦旋振蕩15秒，瞬時離心 即為混合文庫。

3.2? ?文庫變性

1)? ?將混合文庫混合均勻，根據(jù)下表在1.5mL離心管中依次加入試劑，渦旋振蕩15秒，瞬時離心：

?

室溫放置5分鐘，在上步變性管中加入980μL的雜交緩沖液，混勻，瞬時離心；

2)? ?文庫變性后濃度為20pM，進一步用雜交緩沖液稀釋到12pM-15pM，根據(jù)下表比例進行稀 釋，稀釋后渦旋振蕩15秒，瞬時離心，即為上機文庫。

4. ?? 上機測序 使用適用機型基因測序儀（MiSeqDx），按照儀器標準操作規(guī)程進行檢測。

5.??? 測序數(shù)據(jù)分析 將測序獲得的序列信息數(shù)據(jù)傳輸至《胚胎染色體異倍體分析系統(tǒng)》（北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司研制及生產(chǎn)）運行分析，獲得判讀結果。

1）統(tǒng)計質控信息

人類基因組（human assemblyGRCh37/hg19)）比對后的原始數(shù)據(jù)使用samtools剔除基因組重復區(qū)域的序列（Reads），以避免重復序列對分析結果造成影響。同時去除比對質量（Map?Quality）低于8、多匹配和非完全匹配到染色體上的堿基序列，以確保測序數(shù)據(jù)的準確性以及每條堿基序列定位的唯一性，從而得到有效序列。根據(jù)得到的序列，統(tǒng)計樣本中唯一匹配序列數(shù)（UniqueReads）、堿基覆蓋度（Coverage）、序列總數(shù)（Total reads）、線粒體比例（MT Ratio）、比對率（MapRatio）、冗余度（Duplication）和GC含量（GCRatio）等。

2）GC校正 將上一步得到的有效序列分配到事先劃分好的200kb片段大小的基因組非重疊區(qū)域（窗口）中，然后進行GC校正，詳細步驟為：首先計算每個窗口區(qū)域的基因組GC含量；然后以樣本所有窗口的序列數(shù)平均數(shù)與該GC含量水平內(nèi)窗口序列平均數(shù)的比值作為窗口GC校正權重，重新計算窗口序列含量（Reads Count，RC）。

3）均一化校正 對每個樣本測序數(shù)據(jù)量進行均一化后計算窗口的檢測信號值（RCid），計算公式如下：

RCi為染色體第i個窗口的RC值；正常樣本RCid理論值為20。

4）隱馬爾可夫模型分區(qū)

經(jīng)過校正的檢測信號值，使用隱馬爾可夫模型（HiddenMarkovModel，HMM）計算判定其 異倍性。設定染色體狀態(tài)為五種：0、10、20、30和40，分別代表缺失、單倍體、二倍體、三倍 體和四倍體。相同狀態(tài)間的轉移概率設為0.999，不同狀態(tài)間的轉移概率為0.00025。通過統(tǒng)計已 知核型樣本的各窗口RCid值，計算得到HMM計算中所需要的發(fā)射概率矩陣，通過轉移概率矩陣 和發(fā)射概率矩陣及校正后樣本的RCid值計算樣本中各染色體片段的拷貝數(shù)狀態(tài)概率，預測每個片 段區(qū)域的拷貝數(shù)狀態(tài)。根據(jù)連續(xù)片段區(qū)域的狀態(tài)對片段區(qū)域進行分區(qū)。

5）判斷結果

計算染色體所包含窗口檢測信號值（RCid）的平均值作為整條染色體的檢測信號值（RCid），根據(jù)參考范圍判斷染色體拷貝數(shù)，生成報告結果，修改數(shù)據(jù)分析狀態(tài)，并將分析結 果返回到報告查看界面。計算分區(qū)信號值（RCid），根據(jù)參考范圍判斷分區(qū)拷貝數(shù)，若為異常則進行提示。

6）查看報告

a)? 若檢測樣本中的某條染色體的RCid值≥26.97或≤12.97，則表示該樣本的該染色體存在 非整倍體異常，否則表示該次檢測未發(fā)現(xiàn)非整倍體異常。

b) ?若某條染色體的RCid值為0，應判定為此樣本未檢測出該染色體，同時對于常染色體而言，此種檢測結果為陽性純合缺失，對于性染色體而言，此種檢測結果應將X、Y檢測結果共同判斷；

c)對于X、Y染色體檢測結果應共同判斷，若X染色體檢測結果為單體同時Y染色體檢測結 果為單體，則此樣本X、Y染色體檢測結果應判定為未發(fā)現(xiàn)非整倍體異常，不能分別判定為單體 陽性（非整倍體異常）；

d) ?本產(chǎn)品對于某些染色體多倍體陽性的情況，檢測結果均表示為三體陽性。

6.??? 質控標準

6.1 ??每個樣本的唯一比對有效數(shù)據(jù)量（reads數(shù)）≥1M；

6.2 ??每個樣本的基因組覆蓋度≥4%；

6.3 ??對照品1的檢測結果為21號染色體三體；

6.4 ??對照品2的檢測結果為性染色體單體；

6.5 ??對照品3的檢測結果為陰性。

以上需要同時滿足。

?

【參考范圍】

通過Z值法確定樣本參考范圍，并經(jīng)350例陰性囊胚活檢樣本和400例陽性囊胚活檢樣本測序分析驗證，計算每個樣本的24條染色體的RCid值，最終確定參考值的范圍。對于臨界值樣本，我 們通過對臨床樣本及企業(yè)參考品進行統(tǒng)計分析，從而得出臨界值范圍的上下限。

根據(jù)本試劑盒的研究資料，確定樣本染色體RCid值的參考范圍如下表所示。

【檢驗結果的解釋】?

1. ?? 常染色體：常染色體的Rcid≤12.97或RCid≥26.97，分別表明檢測樣本的該條染色體為單體或三體（某條染色體多倍體陽性的情況，檢測結果均表示為三體），即該條染色體存在非 整倍體異常。

2. ?? 性染色體：當X染色體的RCid值為12.97＜RCid＜26.97，且Y染色體的RCid值為0；或X、Y 染色體的Rcid值均≤12.97且不為0時，表明性染色體未見非整倍體異常，其他情況均為存在 非整倍體異常。

3. ?? 當任意1條染色體的RCid值為23.17＜RCid＜26.97或者12.97＜RCid＜17.90時，表明該染色體 為二體，但可能存在染色體片段異常或嵌合風險，可結合其他臨床指征處理。

?

【檢驗方法的局限性】

1.本試劑盒只用于檢測染色體數(shù)目異常，檢出結果僅供臨床參考，不能單獨作為確診或者排除病例的依據(jù)。

2.本試劑盒不能用于夫妻一方為平衡易位、染色體結構異常等造成的胚胎染色體結構變異的?檢測。

3.對于小于等于4M的染色體拷貝數(shù)變異及嵌合比例不大于30%嵌合體樣本，本試劑盒檢出率 較低。

4.本試劑盒不能檢測單倍體、三倍體、多倍體等全部染色體整倍增加或減少的異常。

5.在少數(shù)情況下，鑒于當前醫(yī)學檢測技術水平、個體差異以及樣本運輸?shù)仍颍赡軐е虏?分胚胎樣本無法檢測。

【產(chǎn)品性能指標】

國家參考品/企業(yè)參考品檢測

1.建庫質量?

采用國家參考品或經(jīng)標化的企業(yè)參考品，試劑盒文庫構建失敗率不超過3.0%。

2.數(shù)據(jù)量控制?

采用數(shù)據(jù)量控制國家參考品或經(jīng)標化的企業(yè)參考品，檢測的唯一比對有效數(shù)據(jù)量應不低于1M，基因組覆蓋率不低于4%。在滿足建庫質量和數(shù)據(jù)量控制前提下，達到下列技術指標：

3.陽性參考品符合率?

采用國家參考品或經(jīng)標化的企業(yè)參考品，異常片段大小大于4M的陽性參考品對應的染色體異常要求檢出率達到100%，異常片段大小小于等于4M的陽性參考品對應的染色體異常檢出率要求 達到50%以上。

4.陰性參考品符合率?

采用國家參考品或經(jīng)標化的企業(yè)參考品，陰性參考品應不得檢出染色體異常。

5.嵌合體參考品符合率

采用國家參考品或經(jīng)標化的企業(yè)參考品，對30%嵌合的嵌合體樣本檢出率應達到30%以上， 70%嵌合體樣本檢出率應達到60%以上。

6.重復性

高通量測序檢測系統(tǒng)使用同一批次試劑盒進行三次重復試驗，要求三次試驗結果在滿足建庫質量和數(shù)據(jù)量控制前提下，每次均滿足1-5 檢測要求。

7.臨床試驗情況

臨床試驗采用對比驗證試驗設計，每例納入統(tǒng)計的樣本均采用本試劑盒和金標準對比驗證方法進行檢測。染色體非整倍體陽性金標準對比驗證方法為熒光原位雜交(FISH)；染色體非整倍體陰性金標準對比驗證方法為染色體核型分析，包括產(chǎn)前診斷羊水穿刺核型分析、流產(chǎn)組織核 型分析。

本試劑盒臨床試驗篩選1221對受試者夫妻入組并完成檢測，在1221對受試者夫妻的4640例胚胎樣本中，檢測出染色體非整倍體陽性1494例，染色體非整倍體陰性3135例。陽性樣本FISH驗證533例，陰性樣本隨訪到核型分析檢查結果223例。通過對受試者和胚胎的基線特征分析，表明本臨床試驗的受試者及胚胎能夠代表臨床的實際情況，本試劑盒已驗證樣本的統(tǒng)計 分析結果具有臨床意義。統(tǒng)計分析結果顯示，與金標準對照方法相比，本試劑盒檢測胚胎染色體非整倍體的靈敏性為100%（95%CI：99.00%-100%），特異性為98.2%（95%CI：95.6%~99.5%），準確性為99.5%（95%CI：98.7%~99.9%）；本試劑盒檢測胚胎染色體非整倍 體的陽性預測值為99.2%(95%CI：98.1%～99.8%)，陰性預測值為100.0%(95%CI：98.4%～ 100.0%)；進行Kappa一致性檢驗，Kappa=0.99（p＜0.01）），顯示本試劑盒與金標準對照方法具有良好的檢測一致性。

?

【注意事項】?

1.本產(chǎn)品僅用于體外診斷。

2.臨床實驗室應嚴格按照《醫(yī)療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)（2010）194號）等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。試驗人員必須進行專業(yè)培訓，嚴格按照說明書操作，按照試驗過程嚴格分區(qū)進行（試劑準備區(qū)、標本制備 區(qū)、擴增和產(chǎn)物分析區(qū)），試驗操作的每個階段使用專用的儀器和設備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用。

3.操作注意安全防護。樣品提取應在規(guī)定的實驗場所進行，穿戴防護衣物、一次性手套和口 罩，所有直接接觸過樣品的物體應進行消毒后丟棄或再次使用。

4.所使用的接觸試劑的材料均要求干燥、潔凈，以防止污染。試驗過程中所涉及的耗材為一 次性使用，不得重復使用。

5.使用前，液體試劑應混合均勻，盡量避免反復凍融。

6.操作過程中，盡量減少熒光試劑的曝光時間。

7.本試劑一次性使用，不同批號試劑禁止交叉使用，請勿使用過期試劑。

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【基本信息】

注冊人/生產(chǎn)企業(yè)名稱：北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司

住所：北京市大興區(qū)中關村科技園區(qū)大興生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)基地天榮街19號院6幢204室?

聯(lián)系方式：010-68056969

售后服務單位名稱：北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司?

聯(lián)系方式：010-68056969

生產(chǎn)地址：北京市大興區(qū)中關村科技園區(qū)大興生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)基地天榮街19號院6幢204室

【醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)許可證編號】

【醫(yī)療器械注冊證書編號】

【產(chǎn)品技術要求編號】

【說明書核準及修改日期】