近年來，造成人類感染的病原微生物日益復雜，種類增多，抗菌藥物濫用致使細菌耐藥，病原微生物已成為全球關注的焦點。感染是急危重癥患者死亡的主要原因之一，隨著新發病原微生物的出現、耐藥病原微生物的增多以及免疫抑制宿主的增加，感染的發病率和死亡率居高不下。
據WHO統計，在全球，感染性疾病導致患者死亡占全部死因的25%以上，每年1300萬兒童死于感染性疾病。在中國，感染性疾病占所有疾病的50%以上，造血系統腫瘤患者75%死于感染，實體腫瘤患者50%死于感染，膿毒癥（嚴重感染）患者病死率高達50%。重癥感染起病急、進展快、病原體復雜，短時間內能否明確致病病原微生物至關重要。
面對重癥感染患者，能否快速確認感染病原體，成為后續對癥治療的關鍵，基于宏基因組新一代測序技術（metagenomics next-generation sequencing, mNGS）為解決這一問題提供了一個可能的突破方向。
傳統的微生物鑒定方法分為培養和非培養兩類，臨床公認的“金標準”是分離培養和生化鑒定，這種方法的操作周期長、失敗率高，并且不是每種病原體都可以培養。不依賴培養的方法比如涂片鏡檢、抗體抗原免疫等，在采樣當天即可報告結果。
這些方法的時效性強，但在敏感性和特異性上存在較明顯的劣勢，而且傳統的微生物鑒定方法對于未知或者罕見的病原微生物，無法快速識別。mNGS不依賴于傳統的微生物培養，也無需特異性擴增，直接對臨床樣本中的核酸進行無差別、無選擇性的高通量測序，然后與已知的微生物序列數據庫進行比對分析，根據比對到的序列信息來判斷樣本包含的病原微生物種類，能夠快速、客觀地檢測臨床樣本中的病原微生物（包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲）。
在急危重癥感染中，患者往往因為遺傳性疾病、腫瘤、營養不良、器官移植、藥物等因素導致免疫缺陷，除了遭受普通感染外，尤其容易受到機會性感染，即條件致病菌引起的感染。這類感染涉及的微生物種類復雜，很難根據經驗提前預判，常規檢測方法無法覆蓋。
相比之下，mNGS理論上可以報告所有已知基因組序列的病原體，目前已經納入的病原體有8000多種，其中包括3000余種細菌、4000余種病毒、200余種真菌和140種寄生蟲，除了病原體覆蓋廣、準確性高，mNGS還可以獲取耐藥突變信息和毒力基因，高覆蓋度的mNGS還可以評估病原體的藥物敏感性，精準指導臨床用藥。
憑借上述優點，mNGS逐漸開始被一些臨床醫生認可和嘗試使用，相關的臨床指南和專家共識也對mNGS有所提及，2017年，《中國利士曼原蟲感染診斷和治療專家共識》提到：“有文獻報告用二代測序等方法成功診斷骨髓穿刺與活組織檢查未能發現的病例，將來有可能應用于臨床。”。
2018年，《兒童呼吸道感染微生物檢驗標本采集 轉運與檢測建議（細菌篇）》指出：“高通量的宏基因組測序是對感染性疾病病原體的大規模核酸分析，可提供極為豐富的信息，對于未知病原體的發現具有不可比擬的優勢，是分子生物學診斷的研究熱點。”
《兒童呼吸道感染微生物檢驗標本采集 轉運與檢測建議（病毒篇）》提到：“二代測序技術不但在高通量方面表現出優勢，而且在發現新病原方面也有突破性進展，但目前二代測序的結果還需要驗證，不能直接用于臨床診斷，且費用較高，要廣泛應用尚待時日。”
《終末期肝病合并感染診治專家共識》提到：“二代測序方法從組織、拭子、抽吸物中提取DNA進行分析，可篩查鑒別多種細菌，快速獲取病原學診斷。”
《中國成人醫院獲得性肺炎與呼吸機相關肺炎診斷和治療指南（2018版）》指出：“基于測序技術的臨床宏基因組學可用于快速鑒定細菌、真菌、分枝桿菌、病毒等病原微生物及其耐藥性，但技術成本高，僅限在有條件的單位開展。”2019年，《宏基因組分析和診斷技術在急危重癥感染應用的專家共識》發布。
由已有發布的臨床指南和專家共識可以看出，雖然在指南和專家共識中開始對mNGS有所提及和推薦，但幾乎所有的指南和專家共識仍然對其持比較謹慎的態度，對其目前結果的驗證、檢測的成本和開展的條件等方面都給出了尚不成熟的提示。
mNGS作為二代測序成本快速降低而興起的一門全新領域，若用于體外診斷試劑的研發，有其優勢，但也存在很多技術和法規監管中的難點，本文初步總結如下。
mNGS需要對不同類型的臨床樣本進行預處理，操作步驟包括但不限于：核酸提取、文庫制備、純化、定量、上機前質控等。再加上測序反應和數據分析，整體流程復雜、耗時長，自動化程度低。大多數文庫制備方法包含PCR擴增步驟，有可能產生氣溶膠污染，在實際臨床取樣、運輸、樣本處理、上機測序等環節中都有可能受到環境、容器、試劑中的微生物核酸污染。因此實驗室在防止污染和質量控制上需要建立一系列標準化SOP。
mNGS可以覆蓋8000種以上病原體，檢測靈敏度很高。但這是把雙刃劍，一方面有可能受到環境、容器、試劑中的微生物核酸污染；另一方面，人體含有定植性的微生物（不同個體、不同樣本類型，定植微生物的種類和豐度有較大差異）。這些因素都會導致mNGS結果中含有大量非致病性微生物，而真實的病原體則隱藏在定植和背景微生物中。因此，如何結合樣本類型、實驗對照和臨床信息來準確判斷病原體，是必須攻克的難題。對于mNGS的檢測報告，檢測機構應盡可能提供檢測列表，而不是做出判斷，由臨床醫生結合檢測結果和臨床病史做出判斷。
對于胞內感染菌因釋放到體液中含量較少而導致檢測敏感性偏低，對具有較厚細胞壁的病原微生物如真菌感染，由于核酸提取效率較低，導致臨床檢出率和敏感性較低。因此即使在檢測報告中某種胞內菌/厚壁菌檢出序列數不高，也要考慮其為致病病原體的可能。mNGS信息量大，不可能在報告中列舉出所有檢測到的病原體，對于罕見病原體、胞內菌等，可能因檢出序列數少、微生物豐度低，在報告中未能列舉，如果臨床有疑似特殊病原體的感染，應該可以追溯原始數據庫進行查詢。?
一些病毒的基因組為RNA，用DNA建庫的方法不能檢出。同時，RNA豐度與基因轉錄活躍程度正相關，檢測RNA可以識別死菌和活菌，區分現行和既往感染。因此，DNA+RNA測序與DNA測序相比具有多重優勢，但人源RNA比DNA有更高的豐度和復雜度，且RNA易降解，對樣本運輸和保存有更高的要求。如何穩定有效地實現DNA和RNA同時檢測，是提升mNGS臨床檢出率和準確性的保障之一。
人體不同的樣本類型單位體積含有的細胞數量有巨大的差異，最終的測序數據由微生物序列和人源基因組序列組成，不同數量的人體細胞數、病原微生物感染的類型和感染量的高低都會影響測序數據中目標微生物序列占比，大量的人體背景細胞（如全血樣本）以及很多病原體感染后含量很低，包括用藥后取樣導致的病原數量降低，都會導致限定數據量中靶病原信息太少而丟失。單純擴?數據量，提高檢測深度是最簡單的辦法，但同時會帶來檢測成本的大幅度上升，如何平衡臨床靈敏度的需求和檢測成本的迅速增加，可能是mNGS面臨的最大挑戰。
目前使用mNGS進行藥敏檢測還存在一定的困難，一是目前報道的耐藥基因型與耐藥表型的關聯程度還存在一些差距；二是如果要應用mNGS對臨床樣本進行耐藥相關基因的分析，那將需要極高的測序深度，成本將數千倍地上升，因此，當前的mNGS尚不能完全指導耐藥菌抗感染藥物的選擇。
目前微生物檢驗室對于微生物的鑒定有一套成熟的檢驗流程，mNGS作為一種全新的檢測手段，如何在當前微生物檢驗流程中找到適合的切入點，如何科學地設計產品、合理地選擇預期人群并在在正確的時機開展檢測，找到適合的應用場景是mNGS作為一種實驗室新興技術向產業化轉變的關鍵。
mNGS作為一項優勢明顯的技術，向產業化轉變是必然的趨勢，在醫療器械監管的過程中，尤其是體外診斷試劑審評過程中，以下一些方面應該重點考慮。
1、規范臨床適應人群及臨床適應癥。根據目前的臨床經驗、研究結果和mNGS技術的優勢，mNGS的臨床適應人群應以急危重癥感染患者為主，其主要適應癥包括：
②特殊病人如免疫抑制宿主、合并基礎疾病、反復住院的重癥感染患者需要盡快明確病原體；
⑥長期發熱和/或伴有其他臨床癥狀、病因不明的感染。
2、應結合患者負擔和收益比，重點對產品的臨床意義進行審評。
3、mNGS可以早期發現病原體，指導抗菌藥物的精準選擇，減少抗菌藥物的使用，降低患者的病死率，但尚需要大樣本的研究證實，因此，mNGS的產品在臨床試驗階段應根據其產品設計，選擇預期用途的適用人群進行足夠樣本量的驗證。同時，由于mNGS產品臨床可能的適應人群的特殊性和罕見性，在入組足夠數量的人群時可能會存在較大的困難，這一點可能將是以后臨床審評中的難點。
4、對于嚴重感染、生命體征不穩定的患者，由mNGS獲得致病病原體后，針對病原體進行精準治療，治療后應密切隨訪患者的臨床表現和治療效果，因此應有部分的隨訪數據。
5、病原特征數據庫與算法要有系統研發，在審評中對算法的審評應結合數據庫一起作為審評的重點環節，不能簡單認為把公共數據庫中的微生物納入越多越好。
目前由于該類產品的轉化仍存在一定的難度，尚無體外診斷類產品申報和獲批。
文章來源：CMDE 中國器審，臨床與生物統計二部?胡鵬 供稿
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