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3年經(jīng)驗總結(jié)！新冠檢測實驗室，核酸氣溶膠污染避坑指南！

日期:2022-11-16

核酸檢測實驗室想完全杜絕核酸污染是不可能的。核酸檢測實驗室的管理者和實驗人員必須要認(rèn)識到核酸污染是不可避免的，但是污染的頻率和概率是可控的。我們要做的是時刻保持警惕，盡最大努力將污染的概率降到最低，并且能第一時間發(fā)現(xiàn)污染并及時進(jìn)行處理。

先說說有史以來影響最大的實驗室核酸污染事件

當(dāng)?shù)貢r間2020年4月18日，《華盛頓郵報》(Washington Post)爆了一則重磅新聞，美國CDC在實驗室生產(chǎn)的新冠病毒檢測試劑出現(xiàn)了污染問題，導(dǎo)致全美的核酸檢測推遲最少一個月。1月21日，CDC已經(jīng)“確定開發(fā)”了新冠病毒的檢測方法，并使用它來確認(rèn)美國的第一例新冠病例，1月下旬，美國CDC對26個公共衛(wèi)生實驗室發(fā)放新冠病毒試劑盒，有24個實驗室出現(xiàn)了假陽性反應(yīng)。

CDC緊急召回了診斷試劑，直到3月2日，CDC的新冠病毒試劑由Integrated DNA Technologies，IDT公司生產(chǎn)重新投入使用。這起實驗室污染的代價是美國錯過了黃金的疫情防控窗口，數(shù)萬甚至數(shù)十萬普通民眾死亡。每一個實驗室都應(yīng)該把這個教訓(xùn)銘記在心，時刻提醒自己，核酸污染隨時都可能發(fā)生，無論什么級別的實驗室都可能發(fā)生。

一、核酸氣溶膠污染的來源

陽性質(zhì)控品

較常見，發(fā)生概率在40%~60%之間；以重組質(zhì)粒作為陽性質(zhì)控品，發(fā)生污染的概率更大；

以構(gòu)建的假病毒或重組病毒作為陽性質(zhì)控品，參與核酸提取的過程中，也容易發(fā)生氣溶膠污染；在試劑的配制過程中，接觸了污染的容器、移液器、槍頭、溶液，核酸氣溶膠等，導(dǎo)致試劑被污染。

筆者認(rèn)為，這是目前實驗室引起的核酸污染最主要原因！

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

尤其是是第一代PCR技術(shù)，發(fā)生概率在60%以上；PCR產(chǎn)物經(jīng)反復(fù)多次的擴(kuò)增，其復(fù)制量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過PCR的檢測極限。

一個氣溶膠所包含的拷貝數(shù)可以在10⁴~10⁶copies，因此即使是極微量的污染也足以造成實驗結(jié)果假陽性。

但是，在采用了UNG/UDG防污染的PCR產(chǎn)品中，擴(kuò)增產(chǎn)物引起的污染概率降至10%左右。

PCR擴(kuò)增管的密封性是預(yù)防擴(kuò)增產(chǎn)物污染的關(guān)鍵。如果密封不嚴(yán)，擴(kuò)增完成后有蒸發(fā)現(xiàn)象，液面不整齊，或者擴(kuò)增過程中有“炸管”聲音。

待測強陽性樣品

發(fā)生概率在10%~30%之間。

放置樣品的容器被污染或由于容器密封不嚴(yán)導(dǎo)致樣品與外界接觸被污染;待提取樣本中含有強陽性樣本，其提取的樣品中含有高濃度的陽性核酸，形成氣溶膠造成污染。

氣溶膠是由空氣與液體表面摩擦而產(chǎn)生的。開蓋、晃動、加樣器的反復(fù)抽吸等開放式操作，形成核酸氣溶膠從而導(dǎo)致核酸污染。

以上核酸污染來源，均可形成氣溶膠擴(kuò)散至空氣中，或直接吸附到物體表面。因此，應(yīng)尤其重視由氣溶膠導(dǎo)致污染的問題。重度污染假陽性的ct值可在24左右，中度污染ct值在30左右；輕度污染ct值在33左右。

從核酸污染的分布來看主要在2個地方：

1、空氣中的核酸氣溶膠污染物：彌散到實驗室各個角落，比較棘手；

2、物表的核酸污染物：移液器、離心機、核酸提取儀、傳遞窗、PCR儀、拆開的試劑盒、槍頭盒、打開的耗材等表面。

二、造成核酸污染的原因

原因分類

1.?硬件

嚴(yán)格的PCR實驗室應(yīng)有標(biāo)準(zhǔn)的正負(fù)壓系統(tǒng)及四分區(qū)（或三分區(qū)），實驗室應(yīng)按照生物安全二級實驗室及PCR實驗室設(shè)計基本要求來建設(shè)。可參考的標(biāo)準(zhǔn)為《GB50346-2011建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范》及衛(wèi)健委下發(fā)的《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室工作導(dǎo)則》。標(biāo)準(zhǔn)實驗室如下圖：

醫(yī)療口的實驗室大多符合要求，在科研口和農(nóng)業(yè)口的實驗室應(yīng)重視實驗室的規(guī)范性建設(shè)！軟件配置應(yīng)按照衛(wèi)健委相關(guān)技術(shù)文件規(guī)定，人員配置應(yīng)專區(qū)專人，人員不可不同分區(qū)混用，物流、人流、氣流做到單向流動！

臨床上，門診的新冠快檢PCR實驗室（或免提取方法）多半不規(guī)范。沒有嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)PCR實驗室建設(shè)，更加容易發(fā)生污染。三分區(qū)（或二分區(qū)）、緩沖間、正負(fù)壓、人員配置2人以上，這些基本要求沒有達(dá)到，更加容易發(fā)生氣溶膠污染。

2. 生物安全柜

現(xiàn)有技術(shù)指導(dǎo)原則，只要求了選擇BSL-Ⅱ級生物安全柜，但并未規(guī)定具體型號。從臨床經(jīng)驗來看，只有B2型生物安全柜可以用于加核酸模板。

A1型、A2型、B1型，循環(huán)風(fēng)很容易造成核酸氣溶膠的形成，從而造成污染，且污染很難清除。B2型為全排放，無循環(huán)風(fēng)，可以用于加核酸模板。

3.常見的消毒措施并不能有效降解核酸

紫外燈能殺滅病毒，但是《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室工作導(dǎo)則》指出，短片段的基因核酸對紫外線損傷不敏感。

常規(guī)消毒劑如酒精、碘化物、戊二醛類、季銨鹽等雖然能殺菌，但是不能降解核酸，或降解效率較差。

尤其是酒精，它其實是核酸提取試劑中的一個組分，對核酸沒有任何降解作用。已知的消毒劑中，次氯酸鹽類消毒劑可以一定程度的降解核酸，但是腐蝕性強，不能處理精密儀器及金屬制品，容易腐蝕移液器吸桿影響tip頭氣密性。

4. 那些容易忽視的操作細(xì)節(jié)

吸取陽性對照（質(zhì)粒）沒有遵循“慢吸快打”的原則（這個需要練習(xí)形成“肌肉記憶”），新手往往是“快吸快打”，造成陽性樣品污染槍頭，或者在生物安全柜循環(huán)風(fēng)的影響下，造成氣溶膠飛濺，污染加樣區(qū)域。應(yīng)使用帶有濾芯的槍頭。?

帶濾芯槍頭

4.2 加樣區(qū)沒有放置臺面醫(yī)療器械創(chuàng)新網(wǎng)：應(yīng)把加完樣的tip槍頭，丟入含有次氯酸溶液的加蓋醫(yī)療器械創(chuàng)新網(wǎng)中。因為次氯酸容易揮發(fā)，因此應(yīng)每天都要更換含氯消毒液！

桌面醫(yī)療器械創(chuàng)新網(wǎng)（利器盒）?

5.污染高風(fēng)險區(qū)域

在筆者的臨床實踐中，發(fā)現(xiàn)以下區(qū)域存在陽性污染的概率更大：

污染風(fēng)險排行榜：

2區(qū)＞3區(qū)＞1區(qū)；

生物安全柜＞核酸提取儀＞移液器＞PCR擴(kuò)增儀（PCR管密封性）＞離心機；

陽性質(zhì)控品＞強陽性樣本＞PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（無UNG技術(shù)）＞PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（UNG技術(shù)），PCR管密封性是擴(kuò)增產(chǎn)物是否引起污染的關(guān)鍵。

如同，幸福的家庭都一樣，不幸的家庭各有各的不幸。同理，規(guī)范的實驗室都一樣，污染的實驗室各有各染情況。以上數(shù)據(jù)僅供參考。

三、核酸污染的預(yù)防措施

1.實驗室布局

核酸檢測實驗室的布局是預(yù)防污染的根本，合理布局可以大大降低污染的概率。一般情況分為四個區(qū)分別為試劑準(zhǔn)備區(qū)，標(biāo)本制備區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)。對于不需要電泳的熒光定量PCR，核酸擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可以合并。每個區(qū)應(yīng)獨立通風(fēng)，可控制空氣流動方向。

(圖片來自《實時熒光PCR技術(shù)》)

有些核酸檢測實驗室在實驗室建設(shè)時未考慮到核酸擴(kuò)增需求，就是按照普通實驗室建設(shè)。這種情況下，個人建議擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)應(yīng)遠(yuǎn)離試劑準(zhǔn)備區(qū)和標(biāo)本制備區(qū)，盡量不在一個樓層或者不在一個區(qū)域。最忌諱的是幾個實驗室緊挨著，甚至門對門。

另外建議廢棄物處理的房間也要遠(yuǎn)離以上實驗室，避免廢棄物處理過程中產(chǎn)生的污染。

2.每個區(qū)域的物品專用

四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別。

3.人流物流單向流動

進(jìn)入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)(簡稱擴(kuò)增區(qū))至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。

4.人員培訓(xùn)管理

再好的實驗室設(shè)計，如果實驗人員不遵守規(guī)程，一切都是徒勞的。加強實驗室人員的培訓(xùn)和管理至關(guān)重要。

5.質(zhì)控

陰性質(zhì)控：實驗室的核酸污染風(fēng)險跟檢測量正相關(guān)，因此在檢測活動比較頻繁時需要多添加陰性質(zhì)控，包括陰性樣品，陰性提取對照，陰性擴(kuò)增對照，無模板對照，甚至可以使用反應(yīng)體系，引物探針和提取試劑等作為對照以檢驗檢測流程和反應(yīng)系統(tǒng)組分的污染。陰性對照可以使用幾個隨機插入檢測樣品。保證出現(xiàn)污染可以第一時間發(fā)現(xiàn)。

陽性質(zhì)控：避免或減少使用過強的質(zhì)粒陽性對照。

6.PCR產(chǎn)物的處理

有一些規(guī)范建議PCR產(chǎn)物使用1mol/L鹽酸浸泡，我認(rèn)為這極易造成PCR產(chǎn)物的暴露和擴(kuò)散，具有很高的風(fēng)險。還有一些實驗室從生物安全的角度將所有的實驗廢棄物全部高壓，我也是不建議的，因為PCR產(chǎn)物沒有生物安全風(fēng)險，高壓會造成PCR產(chǎn)物擴(kuò)散，對實驗室的污染風(fēng)險更高。個人建議對于PCR產(chǎn)物，進(jìn)行表面消毒后按照普通醫(yī)療廢棄物處理即可。

7.檢測方法的選擇

對于一般的核酸檢測實驗室，推薦使用封閉擴(kuò)增的熒光定量PCR方法進(jìn)行核酸檢測。不推薦使用普通PCR方法和巢氏PCR，使用這兩種方法實驗室污染是大概率事件。謹(jǐn)慎使用等溫擴(kuò)增的方法，等溫擴(kuò)增的酶反應(yīng)效率更高，產(chǎn)物中模板含量也更高，污染的概率也會提高。

8.實驗操作

操作核酸時動作要輕柔，移液器吸液慢吸慢放，開管蓋要慢慢開，避免操作產(chǎn)生氣溶膠。使用渦動混勻后，稍稍靜置一會再開管蓋，推薦使用移液器緩慢吹吸混勻。

9含尿嘧啶糖苷酶（UNG）試劑的使用

其原理是用dUTP 代替dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進(jìn)行PCR 擴(kuò)增前，用UNG 處理PCR 混合液即可消除PCR 產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG 在PCR 循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU 的新的PCR 產(chǎn)物。

10.試劑耗材要求

所有試驗物品盡可能分裝成小包裝：耗材開包后分裝成一周使用量，用自封袋封好。試劑也盡可能購買小包裝或者回實驗室分裝，實驗中經(jīng)常用到配液的水尤其需要分裝。實驗中所有吸頭都應(yīng)使用帶濾芯的吸頭。

四、核酸污染的處理方案

發(fā)現(xiàn)污染第一步就是要暫停實驗，評估假陽性對以往檢測結(jié)果的影響。對實驗進(jìn)行徹底打掃和清理，盡可能更換相關(guān)的試劑耗材，對儀器設(shè)備進(jìn)行清潔和去核酸處理。所有人員回家洗澡換衣服。

1.化學(xué)處理法

使用商品化的DNA去除劑，有好用的DNA去除劑大家可以推薦給我

1?mol/l的鹽酸和各種化學(xué)物質(zhì)去降解DNA。

(圖片來自《實時熒光PCR技術(shù)》)

2.物理處理法

使用紫外燈照射。

3.佛系處理法

停下所有實驗，靠風(fēng)和時間抹掉核酸的痕跡。這是我最常用的方法，通風(fēng)是最有效的方式。

4.偷天換日法

如果是擴(kuò)增產(chǎn)物污染，在不去除污染的情況下仍然可以進(jìn)行檢測。方法是使用另一種方法或試劑盒，只要兩種試劑的擴(kuò)增產(chǎn)物不一致，沒有交叉反應(yīng)，仍然可以繼續(xù)試驗。但是這種方法要進(jìn)行測試，我并不推薦這么做。

核酸污染處理的難點

1.移液器

移液器內(nèi)部被污染很難去除，可以通過清洗或者另換一套移液器。

2.生物安全柜

移除內(nèi)部所有物品，用DNA去除劑擦拭表面后，打開柜門連續(xù)運行。

3.核酸提取儀內(nèi)部

用DNA去除劑擦拭內(nèi)表面后，打開提取儀門或外罩，靜置。

如果能及時發(fā)現(xiàn)污染，通常情況不會太嚴(yán)重，采取上述措施實驗室空置幾天污染會消除。但是如果發(fā)生了很嚴(yán)重的污染，采取上述措施污染仍不能消除，就只能把一切交給時間了。

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